Summary
Un dispositivo automatico microfluidi è stato sviluppato per la circolazione di arricchimento delle cellule nucleate del sangue periferico attraverso la lisi degli eritrociti che garantisce l'isolamento del campione di alta qualità senza perdita di cellule.
Abstract
In tale relazione il protocollo per un dispositivo automatico microfluidi lisi del sangue è dettagliata. Circolanti cellule nucleate (CNC), tra leucociti e cellule endoteliali, offrono una piattaforma ideale per lo stato aggiornato sullo stato immunitario di un individuo. Il protocollo consente di microfluidica per l'arricchimento di CNC, senza perdita di cellule selettive e preparazione variabilità del campione a causa di user-mediata passi. In breve, il protocollo prevede fabbricazione del dispositivo, la raccolta dei campioni, l'installazione del dispositivo e l'esecuzione del sangue attraverso la camera di microfluidica. All'interno del dispositivo di sangue intero si sta rapidamente miscelato con acqua deionizzata per circa 10 secondi in un micron 50 x 150 micron canale microfluidica. In questo arco di tempo eritrociti vengono lisati a causa delle condizioni ipotoniche. Strutture a spina di pesce sul fondo del canale garantire completa miscelazione e l'esposizione delle cellule ad un ambiente costante. Cellule rimanenti vengono restituiti alle condizioni isotonica all'uscita del dispositivo, fisso con 2% paraformaldeide, centrifugato per separare i detriti degli eritrociti dal CNC, e sospese in tampone di flusso per la colorazione e analisi mediante citometria a flusso. I risultati mostrano trame citometria a flusso pulito dispersione con popolazioni CNC salvato. Significato di questo dispositivo e il protocollo entra nello studio e nella comprensione della patogenesi della malattia attraverso l'analisi delle popolazioni CNC. Quindi, l'automazione, l'efficacia e la semplicità del protocollo microfluidica sono dimostrati.
Protocol
Parte 1. Dispositivo di fabbricazione Microfluidic
Uno stampo in silicone maestro del dispositivo lisi microfluidi è stato creato utilizzando le normali tecniche di fotolitografia con l'attrezzatura presso l'Università di Louisville camera bianca [1]. AutoCAD (Autodesk, Inc., San Rafael, CA) è stato utilizzato per generare una maschera di trasparenza (Fineline Imaging, Colorado Springs, CO) per creare repliche negative dei canali. Il dispositivo lisi microfluidica è stato realizzato dal maestro stampo in silicone morbido utilizzando tecniche litografiche con l'elastomero poliestere (dimetilsiloxano) (PDMS; Dow Corning, Midland, MI). L'elastomero con i canali replicati è stato rilasciato, e fori di accesso al canale sono stati forati con una 20-gauge (parti piccole, Miramar, Florida.). Il wafer PDMS è stata irreversibilmente legato ad un vetrino via plasma di ossigeno e testati per la sperimentazione.
Parte 2. Protocollo per l'esecuzione di dispositivo di lisi
Dopo che il dispositivo a microfluidi è stato fabbricato e collaudato, esperimenti con la lisi degli eritrociti sono pronti per iniziare. I dettagli sezione che segue il protocollo per il dispositivo a microfluidi.
2,1 Raccolta dei campioni
- Raccogliere 4 millilitri di campione di sangue dalla vena cubitale mediana, sulla vena dell'avambraccio anteriore del paziente con eparina come anticoagulante in due 2 ml vaccutainers verde in alto.
- Scartare primi 2 ml tubo in quanto contiene staccato cellule mature endoteliali (falsi positivi).
- Risospendere il secondo tubo di mescolare il sangue con eparina girando su e giù; salvare immediatamente in ghiaccio.
- Trasferire 1 ml di sangue in una provetta da 1,5 ml Eppendorf. Processo il campione di sangue immediatamente (entro un'ora dalla raccolta).
2,2 Primo dispositivo microfluidica con PBS
- Ottenere un dispositivo a microfluidi incollato al vetro. Press-fit tubi di accesso (parti piccole, Miramar, FL) di diametro leggermente superiore nelle insenature e di uscita (Figura 1).
- Fissare un 30-gauge siringa (parti piccole, Miramar, FL) per il tubo su ciascuna delle insenature, fornendo la macro per l'interfaccia micro.
- Riempire una siringa da 1 ml con PBS 1X e assicurarsi di sbarazzarsi di bolle sfogliando l'ago della siringa. Collegare il PBS-caricato siringa da 1 ml di ingresso 1 sul dispositivo a microfluidi. Spingere la siringa contenente il PBS 1X delicatamente a mano fino a quando la soluzione fuoriesce di ingresso 2, e poi subito a morsetto di ingresso 2 con una clip standard Raccoglitore di Office
- Continuare a spingere il PBS 1X finché il liquido raggiunge la porta di uscita del dispositivo microfluidica. Una volta che la soluzione esce la presa, bloccare il tubo di uscita con un altro clip legante.
- Continuare a spingere la siringa da 1 ml fino a quando la PBS 1X flussi di ingresso 3, e bloccare l'ingresso di 3 porte con un altro clip legante ufficio. Il dispositivo microfluidica è ora pienamente innescato.
Figura 1. Schema del dispositivo che indica ingressi per rispettive soluzioni e di uscita.
2.3 Preparazione di pompe siringa e soluzione
- Per calibrare le pompe attenersi alla seguente procedura:
- Per la grande pompa a siringa di Harvard (Harvard, PHD Parte 22/2000 # 702000): impostare la configurazione del diametro di 22,5 mm, portata 600 microlitri / min.
- Per la piccola pompa siringa di Harvard (Harvard, Pico Plus. Parte # 702213): impostare la configurazione del diametro di 4,61 millimetri, portata 20 l / min.
- Riempire una siringa da 30 ml con acqua deionizzata sterile. Questo può essere effettuato prelevando la soluzione direttamente dal tubetto da 50 ml. (Etichetta la siringa)
- Riempire una seconda siringa da 30 ml con 2X tampone fosfato-salina (PBS), il 2% paraformaldeide (PFA) utilizzando la procedura descritta al punto 9. (Etichetta la siringa)
- Riempire una siringa da 1 ml con PBS 1X dalle aliquote memorizzati nel provette da 15 ml coniche, utilizzando la procedura descritta al punto 9.
- Collegare la siringa da 30 ml di acqua deionizzata a ingresso 2 e il 2X siringa da 30 ml di PBS per ingresso 3 (assicuratevi di indossare t trappola bolle nel tubo o dispositivo microfluidica). Rimuovere la fascetta da insenature 2 e 3 e il tubo di uscita. Collegare il PBS 1X siringa da 1 ml in entrata 1. Evitare di introdurre bolle compilando l'ago della siringa con un liquido, che collega la siringa, e sfogliando l'ago della siringa per eliminare le bolle.
2,4 lisi degli eritrociti
- Impostare tutte le siringhe sulle pompe di Harvard proprio come indicato di seguito:
- Impostare le due siringhe 30 ml (quella che contiene sterile, acqua deionizzata e l'altro con 2X PBS, 2% PFA) insieme sul grande pompa a siringa Harvard.
- Impostare la siringa da 1 ml (contenente 1X PBS) sulla piccola pompa a siringa Harvard.
- Posizionare il tubo di uscita in un raccoglitore (50 ml tubo conico che viene etichettato wAste).
- Accendere la grande pompa a siringa Harvard (con i 30 ml siringhe) e farlo funzionare per un minuto. (Assicurarsi che non ci siano bolle e le perdite nel dispositivo o nel tubo).
- Accendere la piccola pompa a siringa Harvard e farlo funzionare per un altro minuto. (Assicurarsi che non ci siano bolle e le perdite nel dispositivo o nel tubo). Fermare le pompe. Il dispositivo microfluidica è ora pronto per essere utilizzato.
- Rimuovere la siringa da 1 ml contenente PBS 1X dalla piccola pompa a siringa Harvard.
- Dopo aver ottenuto un campione di sangue, riempire la siringa da 1 ml con 0,05 ml di soluzione sterile di PBS 1X senza intrappolare eventuali bolle. Successivamente, riempire la siringa con 0,5 ml di sangue ottenuto dalla provetta Eppendorf. (La siringa da 1 ml ora contengono un volume di 0,55 ml di sangue e tampone PBS 1X.) Nota: Conservare la siringa verticale durante il riempimento per evitare la miscelazione del 0,05 ml PBS con il sangue.
- Collegare la siringa contenente il sangue di ingresso 1 e montare la siringa con attenzione (evitare di spingere il sangue attraverso il tubo nel dispositivo) sulla piccola pompa a siringa Harvard (la siringa è montato in verticale nella pompa).
- Rimuovere il tubo di uscita dal tubo di scarico e mettere un tubo pulito centrifuga da 50 ml al suo posto e metterlo su un secchio di ghiaccio.
- Accendere la grande pompa a siringa Harvard prima e farlo funzionare per 1 minuto. Iniziare a raccogliere il campione dalla presa di corrente nel tubo da centrifuga da 50 ml.
- Accendere la piccola pompa a siringa Harvard.
- Una volta che il campione di sangue nella siringa da 1 ml ha completamente viaggiato attraverso il dispositivo, stop entrambe le pompe. Questo dovrebbe durare circa 20 minuti.
- Centrifugare il campione raccolto per 5 minuti a 350 xg a temperatura ambiente con l'off freno.
- Rimuovere il surnatante ponendo punta della pipetta sul lato opposto del pellet bianco. Rimuovere la maggior quantità possibile di surnatante, detriti cellulari in particolare quello rosso, senza disturbare il pellet bianco.
- Risospendere il campione in 1 ml di buffer di flusso (1X PBS, 1% BSA [albumina di siero bovino], 2% PFA) pipettando su e giù. Versare il campione in una provetta Eppendorf da 1,5 ml.
- Microcentrifuga prelevato il campione per 5 minuti a 4 xg a temperatura ambiente. Usa precisione come prima di rimuovere il surnatante.
- Risospendere il campione in 1 ml di buffer di flusso con il vortex.
2.5 La preparazione per l'analisi di citometria a flusso
- Per l'analisi del campione in citometria a flusso, aggiungere 100 ml di campione in una provetta citometria a flusso.
- Per la 100 microlitri di campione si aggiungano anticorpi specificato (garantire la concentrazione corretta).
- Lasciare campione ad incubare per 30 minuti a 40 ° C.
- Lavare due volte con tampone di flusso prima di citometria a flusso. Fase di lavaggio comprende l'aggiunta di 250 microlitri di buffer di flusso, vortex, centrifugazione per 5 minuti a 350 xg, e rimuovere il surnatante con un giro fluido di tubo di citometria a flusso.
- Risospendere il pellet in 250 ml di buffer di flusso. Campione è pronto per l'analisi in citometria a flusso.
Rappresentante Risultati
Di sangue intero è stato eseguito attraverso il dispositivo lisi microfluidica e post-elaborazione del protocollo, liberarsi di eritrociti e arricchire circolanti cellule nucleate (CNC). Risultati ideali darà un pulito citometria a flusso scatter plot con separata popolazioni CNC. Visualizzati sotto nelle figure 2 e 3 sono i confronti dispersione trama di un campione di sangue intero senza lisi degli eritrociti e con la lisi degli eritrociti dal protocollo di microfluidica con assi come scatter in avanti (FSC) rispetto side scatter (SSC) della luce. Si può notare che il protocollo di arricchimento microfluidica è necessario per ottenere un ambiente pulito citometria a flusso scatter plot.
Figura 2. Citometria a flusso scatter plot del campione di sangue intero, senza la lisi degli eritrociti con FSC e SSC assi.
Figura 3. Citometria a flusso scatter plot di cellule nucleate circolanti con microfluidica lisi degli eritrociti etichettati da popolazioni con FSC e SSC assi. Regione 1 (rossa) rappresenta linfociti, Regione 2 (verde) rappresenta monociti, Regione 3 (blu) rappresenta granulociti e Regione 4 (viola) non è ancora stata caratterizzata.
Rimozione dei detriti globuli rossi con pipetta nel protocollo è importante anche quando è necessario. Di seguito nella Figura 4 è un grafico a dispersione che mostra un surplus di detriti cellulari rosso. Anche se non opacità del grafico a dispersione come nella figura 2, si deve spiegare gli eventi aggiunti a causa di detriti degli eritrociti durante l'analisi dei dati.
Figura 4. Citometria a flusso scatter plot raffiguranti frammenti di globuli rossi, visto come un clusterdegli eventi nella Regione 5 (ciano).
La colorazione delle cellule per alcuni marcatori fenotipo anticorpi anche generare risultati caratteristici. Nelle figure che seguono sono le macchie di anticorpi fenotipo per 3 distinte popolazioni leucocitarie: linfociti, monociti e granulociti. Figura 5 mostra popolazioni di linfociti tracciati con assi CD3 e CD4. Monociti e granulociti sono illustrati nelle figure 6-7 con assi come FSC contro CD14 e CD66b, rispettivamente.
Figura 5. Citometria a flusso scatter plot raffigurante linfociti con CD3 e CD4 assi.
Figura 6. Citometria a flusso scatter plot raffigurante monociti con FSC e CD14 assi.
Figura 7. Citometria a flusso scatter plot raffigurante granulociti con FSC e assi CD66b.
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Discussion
Un sistema automatizzato microfluidici protocollo di lisi del sangue è stata riportata. All'interno del protocollo sono passaggi critici degni di nota. Nella sezione P.2.1, è importante per scartare il flaconcino prima sangue raccolto, come il campione contiene sloggiato cellule mature endoteliali in qualità di falsi positivi. Inoltre, assicurarsi di eseguire il campione di sangue entro un'ora dalla raccolta. Priming il dispositivo a microfluidi nella sezione P.2.2, è importante per liberare inizialmente delle bolle. Inoltre, si dovrebbe evitare l'introduzione di bolle quando si collega siringhe nuove per gli aghi in tutto il protocollo. Quando si riempie la siringa da 1 ml di sangue nella sezione P.2.4, bisogna ricordarsi di aggiungere prima PBS 1X e il sangue, il tutto mantenendo la siringa in verticale per evitare la mescolanza delle due soluzioni. Prima di avviare la pompa a siringa spingendo il campione di sangue, assicurare la pompa a siringa di grandi dimensioni è stato in esecuzione in modo che il sistema è a pieno regime. Dopo che il campione ha terminato l'esecuzione attraverso il dispositivo e sono stati centrifugati, rimuovere con attenzione il più possibile surnatante, tra i detriti dei globuli rossi, senza disturbare il pellet bianco. Infine, nella sezione pag.2.5 seguire il protocollo del produttore s per garantire la corretta concentrazione di anticorpi è aggiunto al campione 100 ul.
Applicazioni del protocollo microfluidica sono immense nella ricerca clinica. Interrogare lo stato immunitario di un individuo in termini di CNC genera importanti informazioni sulla condizione di salute e può aiutare con la diagnosi e la comprensione della patogenesi della malattia. L'accesso a tali popolazioni CNC attraverso la raccolta del sangue del campione è più facile e più conveniente che analizza l'espressione umana che coinvolge i tessuti tumorali. Per esaminare queste cellule nucleate in circolazione si deve essere in grado di arricchire le popolazioni di altri componenti del sangue, tra cui eritrociti, la funzione primaria del dispositivo riportato. Quindi, tali studi sarebbero trarre grandi vantaggi dal protocollo microfluidica lisi del sangue.
Significato del protocollo di microfluidica emerge in termini di applicazioni. Perché l'arricchimento delle cellule nucleate è richiesto negli studi clinici di sangue, un protocollo che richiede poca esperienza e user-mediata passi che produce risultati chiari e coerenti è importante. Il protocollo microfluidica garantisce la coerenza attraverso l'automazione e l'esposizione controllata di cellule in ambienti gravosi. Con l'uniformità tra i dati clinici dei laboratori saranno direttamente confrontabili [2].
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Acknowledgments
La ricerca è stata sostenuta dal Premio H. Wallace Coulter carriera Fondazione All'inizio della Ricerca Traslazionale. Grazie a Tim Andrews, Pediatric Hematology / Oncology, per aiutare con la raccolta del sangue del campione. Anche grazie al dottor Sam Wellhausen, Citometria a flusso core, James Graham Brown Cancer Center, per aiutare con l'esecuzione di campioni citometria a flusso.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Base | Dow Corning | ||
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Curing Agent | Dow Corning | ||
| 30-gauge syringe needle | Small Parts, Inc. | NE-301PL-25 | |
| Tygon tubing (.010" ID) | Small Parts, Inc. | TGY-010 | |
| 20-gauge syringe needle | Small Parts, Inc. | NE-201PL-25 | |
| Syringe Pump (Harvard PHD 22/2000) | Harvard Apparatus | 702000 | |
| Syringe Pump (Harvard Pico Plus) | Harvard Apparatus | 702213 | |
| Flow cytometry tubes | DB Biosciences | 352052 | |
| Antibody stains | DB Biosciences | ||
| 1.5 ml Eppendorf tubes | Fisher Scientific | 05-402-25 | |
| 50 ml tube | Fisher Scientific | ||
| 1 ml syringe | Fisher Scientific | ||
| 30 ml tube | Fisher Scientific | ||
| Paraformaldehyde (PFA) | Fisher Scientific | ||
| Bovine serum albumin (BSA) | Fisher Scientific | ||
| 10X PBS | Fisher Scientific |
References
- White, W. Clinical application of microfluidic leukocyte enrichment protocol in mild phenotype sickle cell disease (SCD. Biomedical Microdevices. 11 (2), 477-483 (2009).
- Sethu, P. Continuous Flow Microfluidic Device for Rapid Erythrocyte Lysis. Anal. Chem. 76 (21), 6247-6253 (2004).
