Preparação óssea Undecalcified de Histologia, Histomorfometria e Análise Fluorocromo

Resumo

Histologia óssea Undecalcified fornece informações importantes para uma variedade de aplicações clínicas e de pesquisa. É tecnicamente desafiador, especialmente com amostras de grande porte. Este vídeo ilustra o processo de produção de seções de boa qualidade e demonstra as dificuldades técnicas e métodos com os quais a superá-los.

Resumo

Histologia óssea Undecalcified demonstra a micro-arquitetura do osso. Ele mostra tanto os componentes mineralizados e celulares do osso, que fornece informações vitais sobre o turnover ósseo ou formação e reabsorção óssea. Isto tem uma enorme importância em uma variedade de aplicações clínicas e de pesquisa. Ele produz belas imagens ¹ e permite técnicas como a avaliação fluorocromo e histomorfometria ^2. Análise fluorocromo é uma técnica onde corantes fluorescentes que se ligam ao cálcio são injetados em um ponto determinado momento, que permite a quantificação da quantidade de mineralização naquele momento. Histomorfometria é um processo de quantificação do osso ao nível microscópico.

Realizar histologia óssea undecalcified é tecnicamente desafiador, especialmente com amostras de grande porte. Ela exige variações na técnica dos utilizados em parafina padrão incorporado histologia. Este vídeo ilustra o processo de produção de seções de boa qualidade e demonstra as dificuldades técnicas e métodos com os quais a superá-los. Preparação de amostras de fixação e processamento são alcançados com uma forma semelhante a outros tecidos moles, no entanto, devido à densidade e menor permeabilidade do osso consideravelmente maior fixação e os tempos de processamento são necessárias, muitas vezes levando várias semanas. Incorporação é alcançado usando um meio de suporte com dureza semelhantes ou iguais e densidade do osso, como metacrilato de resinas à base, mas ao contrário de infiltração de parafina e incorporação, este é um passo irreversível. Seccionamento pode ser conseguido através de moagem, que produz uma espessa seção, que é ótimo para os estudos, como a análise fluorocromo. Este é o melhor conseguido usando uma lâmina de diamante em uma macrotome. Alternativamente, as seções mais finas podem ser produzidas por microscopia de luz e isso é conseguido usando um micrótomo trenó com uma lâmina muito afiada. O micrótomo sledge fornece a maior resistência e estabilidade necessária para grandes blocos rígidos. Seções de resina incorporado pode ser manchado com uma variedade de manchas, que são demonstradas.

Protocolo

1. O tecido é colocado em um recipiente selado contendo fosfato tamponado a 10% solução de formalina ^3. Garantir que a exposição mínima à luz, se a análise fluorocromo é para ser realizado, como a fluorocromos são sensíveis à luz.
2. Estabelecer qual a orientação do tecido serão necessários.
3. Apare a amostra com o tamanho, na orientação correta, usando uma serra de fita. Medidas de garantir a segurança são cumpridas. A amostra é então colocada em um recipiente opaco, cujo volume deve ser de aproximadamente dez vezes o tamanho da amostra para obter uma fixação adequada. O espécime deve permanecer na solução de formalina um total de entre uma e duas semanas dependendo do seu tamanho. Sugere-se o uso de tecidos de controle para fins de teste e otimização.
4. Verifique o tecido se encaixa no molde de incorporação e coloque o tecido em um recipiente selado opaco contendo etanol 70%.
5. Processo o tecido em ordem crescente as concentrações de etanol, protegendo da luz e sob agitação constante.
   1. 70% de etanol 1 semana
   2. 80% de etanol 1 semana
   3. 90% de etanol 1 semana
   4. 100% de etanol 1 semana
6. O tecido é então apagado em butanol para uma semana, mais uma vez blindagem da luz e sob agitação constante.
7. A densidade da resina e osso devem ser cuidadosamente acompanhado. A densidade da resina pode ser alterada (ver passo 8) e recomendamos a incorporação de um espécime primeiro teste para garantir a densidade correta. Usamos Technovit 7100 (Heraeus Kulzer) para microscopia de luz e análise fluorocromo. Se imunohistoquímica é necessária uma resina alternativa deve ser usada como Technovit 9100 (Heraeus Kulzer).
8. A solução de preparação Technovit 7100 pode ser misturado com pequenas alíquotas da solução de amolecimento fornecido com o kit, se necessário, mas não mais que 5% o volume de solução de preparação, em nossa experiência, a solução de amolecimento raramente é necessário. Partes iguais de etanol absoluto e Technovit base líquida 7100 são misturados e aplicados ao tecido como uma solução de infiltração de pré-por 24 horas minimizando a exposição à luz e com agitação.
9. A solução é, então, a infiltração composto usando um endurecedor g I (= saco 1) que é dissolvido em 100 ml de líquido de base. Isto substitui a solução de pré-infiltração e é permitido para se infiltrar em uma semana sob agitação constante.
10. Coloque o tecido no molde, com o rosto superfície de corte para baixo. Garantir que há uma margem (de preferência, pelo menos, 5 milímetros) em todo o tecido para a resina, o que garante força bloco. Mix 15mls de Technovit solução de preparação 7100 com 1 ml de endurecedor II e despeje em torno de amostra no molde e cobri-lo em pelo menos 5 millimietres. Cura vai começar dentro de 2 horas, mas será concluída durante a noite.
11. Montagem é, então, realizada por formar um bloco de apoio usando Technovit 3040 (Heraeus Kulzer). Mix Technovit 3040 em uma relação de volume de 2 partes de pó para 1 parte de líquido para obter um líquido viscoso. Despeje Technovit 3040 no recesso na parte de trás do bloco a um nível de pelo menos 2 mm acima da base do bloco. Após cerca de 10 minutos, o molde pode ser desfeito, eo bloco está pronto.
12. A densidade e, portanto, as propriedades de corte de resina de metacrilato são suscetíveis à umidade ambiente na sala. Os blocos devem ser armazenados em um dessecador.
13. Seccionamento terra produz seções maiores entre 20-50 micrômetros de espessura. É útil para a análise fluorocromo (ver secção abaixo) como seções mais espessas produzem mais brilhante fluorescência. Fixe o disco de diamante para macrotome. Adicionar lubrificante, como o espírito de petróleo para o reservatório no macrotome. Garantir o bloco no grampo e orientar a lâmina. Permitem moer a ocorrer lentamente (cerca de 20-30 minutos por seção) garantindo a lubrificação adequada. A primeira seção expõe a face de corte e orienta a seção deve ser descartado.
14. A próxima seção é então colocada sobre uma lâmina Além disso Superfrost. A seção tem uma tendência a enrolar por isso, recomendamos colocar uma porção de um saco de sanduíche por cima e, em seguida, segurando-o apartamento com outro slide preso no lugar. É então colocado em uma incubadora de entre 60-80 graus Celsius durante 1 hora. Isto suaviza a metacrilato e ajuda a seção aderir ao deslize de uma forma plana.
15. A seção de solo pode ser limpo e polido, conforme necessário usando lixa fina de uma maneira suave.
16. O micrótomo sledge cortes cortes finos, que proporciona o melhor seções para microsocopy luz. Use um micrótomo trenó como tem adicionado rigidez, que é necessário para o corte desses blocos rígidos. Alternativamente um micrótomo rotativo movido podem ser usados. Use uma lâmina de aço inoxidável afiada. É preferível ter duas lâminas disponíveis como se pode ser afiada como a outra é utilizada. A lâmina deve fazer um ângulo de 45 graus com o bloco. Suamolecimento rface pode ser conseguido pela aplicação de um papel molhado para o bloco, se necessário. Pode levar várias seções para atingir as condições de corte desejado para obter uma seção de qualidade. A seção é então flutuou em um banho de água e colocado sobre uma lâmina como em 16, supra.
17. Reagentes de coloração estão listados em Materiais abaixo. Protocolos são baseados em ^quatro Bancroft et al. Devido à variação de espessura é recomendado para otimizar manchas em lâminas. Rack de coloração dos tecidos pode provocar a flutuar fora do slide para adicionar a manchas diretamente para um slide plana pode ser necessária. Um protocolo idêntico ou coloração rack é necessário para resultados consistentes coloração exigida para histomorfometria.
    1. Hematoxilina e eosina
       1. Mancha com Haematoxyilin 5-10 minutos
       2. Lave bem com água da torneira Scott s
       3. Mancha com Eosina 5 minutos
       4. Lavar em água corrente
       5. Limpar em xilol
       6. Montar
       7. Resultados
          1. Osteóide = rosa
          2. Óssea calcificada = marrom arroxeada
          3. Núcleos = blue
    2. Von Kossa
       1. Lugar em solução de nitrato de prata e expor à luz forte até o osso fica preto (aprox. 10 min)
       2. Lavar em água destilada por três vezes
       3. Ameaça com tiossulfato de sódio por 5 minutos
       4. Lavar em água destilada
       5. Contracoloração com Safrinin O
       6. Limpar em xilol
       7. Montar
       8. Resultados
          1. Óssea Mineralised = preto
          2. Osteóide = vermelho / rosa
    3. Masson Goldner s Trichrome
       1. Lavar com álcool alcalina (90mls de etanol 80% e 10mls de amônia 25% para 20 minutos)
       2. Enxaguar em água
       3. Enxágüe em água destilada
       4. Mancha com Hematoxilina Weigert s por 10 minutos
       5. Enxágüe em água destilada
       6. Mancha com Ponceau-Fucsina solução final 5 minutos
       7. Enxágüe com 1% de ácido acético 15 segundo
       8. Mancha em fosfomolíbdico ácido-laranja solução G 5 minutos
       9. Enxágüe com 1% de ácido acético 15 segundo
       10. Mancha com luz verde 5 minutos
       11. Enxágüe com 1% de ácido acético 3 mudanças
       12. Enxágüe em água destilada
       13. Montar
       14. Resultados
           1. Óssea Mineralised = verde
           2. Osteóide = vermelho / laranja
           3. Núcleos = azul cinza
           4. Cartilagem = roxo
18. Preparações fluorocromo:
19. Estes são administrados por injecção intravenosa lenta, pelo menos duas semanas de intervalo.
20. Doses
    1. Calceína Verde 10 mg / kg IV
    2. Oxitetraciclina 50 mg / kg IV
    3. Alizarina complexona 30 mg / kg IV
21. Preparação de calceína Verde
    1. Um grama de calceína Verde é titulado com NaOH 1 M até dissolver.
    2. pH é ajustado com NaOH 1% até pH = 7,1-7,2.
    3. Filtro e manter protegido da luz
22. Preparação de Alizarina complexona
    1. Três gramas de Alizarina complexona é titulado com NaOH 1 M até dissolver.
    2. pH é ajustado com HCl 1% ou NaOH até pH = 7,1-7,2.
    3. Filtro e manter protegido da luz
23. Preparação de Oxitetraciclina
    1. Oxitetraciclina está disponível como um fora da prateleira de drogas anti-microbial. Não requer preparação.

Materiais

a) solução Hemotoxylin
Hemotoxylin	1g
Álcool absoluto	100mL
b) Solução de Ferro
30% de cloreto férrico aquosa	4mL
Ácido clorídrico (concentrado)	1mL
água destilada	95mL

a) solução de Ponceau xilidina
Ponceau de xilidina	0,75 g
fuchsion ácido	0.25g
Ácido acético	1mL
mix, e adicionar água destilada (100ml)
b) solução azophloxin
Azophloxin	0.5g
Ácido acético	0,6 ml
mix, e adicionar água destilada (100ml)
c) Final solução de trabalho mancha
Ponceau-fucsina solução	5-10ml
Azophloxin	2mL
Solução de ácido acético 0,2%	88mL

Luz verde	1g
ácido acético	1mL
Misture e adicione água destilada (500ml)

Ácido fosfomolíbdico	3g
Laranja G	2g
Dissolver em 500mL de água destilada e adicionar timol cristal.

1% de nitrato de prata aquoso

Tiossulfato de sódio 2,5%

1% de safranina O

Alcian blue 8GX	1g
Solução de ácido acético 3%	100mL

a) hemotoxylin Harris
Hemotoxylin	2.5g
Álcool absoluto	25mL
Alum de potássio	50g
água destilada	500mL
óxido de mercúrio	1,25 g OR
Iodato de sódio	0.5g
Ácido acético glacial	20mL
b) solução de Eosina
Eosina produzido comercialmente foi usado.

Fabricante	Fluorocromo	Número Catálogo
Sigma-Aldrich, Sydney	Calceína Verde	C0875
Sigma-Aldrich, Sydney	Alizarina complexona	A3882
Intervet Austrália, Victoria	Oxitetraciclina (Fora da droga antimicrobiana prateleira)	Comercial; Engemycin 100