Obtenção Hemócitos do Hawaiian Bobtail Squid Euprymna scolopes Observando e sua adesão a bactérias simbióticas e não-simbióticas

Resumo

Este vídeo vai demonstrar como obter hemócitos (células sangüíneas) a partir do Hawaiian bobtail lula, Euprymna scolopes Para utilização em ensaios biológicos de células bacterianas e aderência. Hemócitos serão marcadas com um corante fluorescente e expostos a GFP-rotulados bactérias.

Resumo

Estudos sobre o papel do sistema imunológico na mediação de sinalização molecular entre bactérias benéficas e os seus anfitriões têm, nos últimos anos, fez contribuições significativas para a nossa compreensão da co-evolução dos eucariotos com sua microbiota. A associação simbiótica entre o havaiano bobtail lula,

Protocolo

1. Prepare 500 mL de 0,22 M esterilizada por filtração, a água do mar artificial (FSW; salinidade 35 ppt). Filtro de água do mar artificial ou natural através de um filtro de 0,22 micron M para remover partículas e bactérias.
2. Anestesiar um adulto Hawaiian bobtail squid (Euprymna scolopes), colocando em uma solução 2% de etanol na FSW. Colocar o animal na anestesia por aproximadamente 10 minutos. A lula deixará de natação e não responder ativamente ao toque. Respiração contínua, indicado pelo movimento do manto, ea atividade chromatophore ainda deve ser observado.
3. Lugar squid com o lado ventral para cima em uma bandeja padrão de cera dissecção. Submergir o animal com FSW contendo 2% de etanol.
4. Usando um padrão de 200 mL pontas de pipeta, retirar o funil e manto para expor os principais vasos sanguíneos localizados cefálica entre os dois olhos.
5. Usando uma seringa estéril mL 1 com 26,5 calibre da agulha, punção do vaso sangüíneo cefálico e retirar entre 50-100 mL de hemolinfa. Coloque o hemolinfa em um tubo de 1,5 mL estéril no gelo.
   Nota: Se um animal servirá como um doador de múltiplos vezes, apenas retirar 10-20 mL de hemolinfa a qualquer momento. Devolver o animal para um tanque de água do mar normal. O animal irá reviver dentro de 30 min.
6. Hemócitos de colheita recente são lavadas e re-suspenso em 500 ml de solução Ringer Squid s (S-Ringers; 530 mM NaCl, 10 mM KCl, 25 mM MgCl _2, 10 mM CaCl ₂ e 10 mM tampão HEPES, pH 7,5).
7. Hemócitos concentrações são determinadas por hemocitômetro, e cerca de 2.000 células são adicionadas ao lamínulas câmaras de vidro, e permitiu a aderir ao vidro por 10 min em temperatura ambiente. Neste densidade, o hemócitos formar uma monocamada uniforme sobre a superfície da lâmina de vidro.
8. Observar bacteriana ligação a hemócitos host, hemócitos são expostos a uma cepa bacteriana fluorescente etiquetado como o Vibrio fischeri ES114 e / ou Vibrio harveyi B392, cada um contendo um repórter fluorescente verde. V. fischeri ES114 e V. harveyi B392 são cultivadas para log-mid fase em uma água do mar triptona media (SWT) a 28 ° C em um agitador orbital. A densidade óptica a 600nm é medido espectrofotometricamente para determinar a densidade de células. As bactérias são peletizadas por centrifugação (5.000 rpm por 5 min), o sobrenadante é descartado, eo pellet é ressuspenso em S-Ringers.
9. 100.000 células bacterianas são adicionados a cada câmara de bem para que existem 50 bactérias por hemócitos em média. Os hemócitos misturas / bactérias são incubadas em solução Ringer S-s a 25 ° C durante 1 h, um tempo determinado para produzir o nível máximo de ligação.
10. O citoplasma dos hemócitos são então marcadas com fluorescência 0,005% CellTracker Orange (Invitrogen) e, em seguida, lavados em S-Ringers para visualizar as células.
11. Hemócitos corados com bactérias associadas são vistos por fluorescência utilizando um estereoscópio Zeiss Descoberta V20 fluorescente ou um microscópio Leica SP2 do laser confocal espectral, e enumerou sobre toda a superfície da célula animal.

Resultados representante

Porque hemolinfa cefalópode contém hemocianina e hemoglobina extracelular não, sobre a oxigenação, a hemolinfa ficará azul escuro. Uma média de ~ 5000 hemócitos por mL de hemolinfa serão obtidos utilizando este método. Após a adesão ao lamínulas septadas e coloração fluorescente, o hemócitos deve aparecer brilhante fluorescente vermelha e amoeboid em forma. Para adesão bacteriana, V. fischeri irá aderir mal ao hemócitos (1-2 células bacterianas por célula do sangue), enquanto V. harveyi irá aderir fortemente (10-15 células bacterianas por hemócitos).

Figura 1. Adulto Hawaiian bobtail squid Euprymna scolopes mostrando a posição dos vasos sanguíneos cefálica.

Figura 2. Resultados da exposição hemócitos de Vibrio fischeri (A) e Vibrio harveyi (B). Vermelho, Cell Rastreador Orange; Green, GFP-rotulados bactérias.

Discussão

Estudos sobre o papel do sistema imunológico na mediação de sinalização molecular entre bactérias benéficas e os seus anfitriões têm, nos últimos anos, fez contribuições significativas para a nossa compreensão da co-evolução dos eucariotos com sua microbiota. O sistema squid / vibrio provou-se como um sistema modelo tratável para responder a perguntas fundamentais neste campo ^2,3,5,6,8. A luz de órgãos do Euprymna squid scolopes permite a colonização exclusivamente pela bactéria Vibrio f...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Sistema de lamínulas de borossilicato nº 1.0 com câmara (8 câmaras)	Thermo Fisher Scientific, Inc.	155411
Seringa de insulina sem látex de 1 ml, 26,5 G	BD Biosciences	C34551
Cell Tracker Orange	Invitrogen	C34551
Microscópio SteREO Discovery V20	Carl Zeiss, Inc.
Microscópio Confocal SP2	Leica Microsystems