Respostas eletrofisiológicas de neurônios sensoriais olfativos de odores pode ser medido em insetos usando gravações sensillum único. Neste artigo vamos demonstrar de vídeo como realizar gravações sensillum única nas antenas da mosca do vinagre ( Drosophila melanogaster) E os palpos maxilares do mosquito da malária ( Anopheles gambiae).
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Artigo de método
Único Recordings Sensillum na Insetos Drosophila melanogaster E Anopheles gambiae
Neste artigo
Resumo
Resumo
O sentido do olfato é essencial para insetos para encontrar alimentos, companheiros, predadores, e os locais de oviposição 3. Inseto neurônios sensoriais olfativos (ORS) são colocados em pêlos sensoriais chamados sensilla, que cobrem a superfície dos órgãos olfativos. A superfície de cada sensillum é coberta com minúsculos poros, através do qual odorants passar e dissolver em um líquido chamado linfa sensillum, que banha os dendritos sensorial do ORS alojados em um sensillum dado. Os dendritos OSN expressar odorant receptor (OR) proteínas, que em insetos funcionam como canais iónicos dependentes de odor 4, 5. A interação de odores com ORs aumenta ou diminui a taxa de disparo basal da OSN. Esta atividade neuronal na forma de potenciais de ação incorpora a primeira representação da qualidade, intensidade e características temporais do odorant 6, 7.
Dado o fácil acesso a estes pêlos sensoriais, é possível realizar gravações extracelular de ORS único pela introdução de um eletrodo de registro para a linfa sensillum, enquanto o eletrodo de referência é colocado na linfa dos olhos ou do corpo do inseto. Em Drosophila, sensilla casa entre uma e quatro ORS, mas cada OSN normalmente exibe uma amplitude pico característico. Técnicas de classificação de Spike torná-lo possível atribuir respostas spiking a ORS individual. Este single sensillum técnica de gravação (SSR) monitora a diferença de potencial entre a linfa sensillum eo eletrodo de referência como os pontos elétricos que são gerados pela atividade do receptor de ORS 1, 2, 8. Mudanças no número de espigas, em resposta ao odor representam a base celular do odor de codificação em insetos. Aqui, descrevemos o método de preparação usado atualmente em nosso laboratório para realizar SSR em Drosophila melanogaster e Anopheles gambiae, e mostrar os traços representante induzida pela odores de forma sensillum específicos.
Protocolo
1. Diluições odor
- A maioria dos odores são solúveis em óleo de parafina. No entanto, DMSO ou etanol também pode ser usado como solventes alternativos para odores particular. Preparar diluições apropriadas (por exemplo, volume de 1:10: volume; v: v) de odores pura em frascos de vidro. Diluições mais odor são estáveis à temperatura ambiente, mas para compostos altamente voláteis, é melhor fazer diluições trabalhando em uma base semanal. Cada sensillum responde aos odores diferentes dentro de uma faixa de concentração diferente. Para Drosophila, uma tabela look-up útil para concentrações adequadas para uso com um sensillum dado pode ser encontrada ....
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Discussão
Pistas olfativas são usados por organismos para identificar fontes de alimento, parceiros em potencial, e predadores. Neurônios sensoriais olfativos (ORS) são o centro primeiro relé entre estímulos externos e os centros superiores do cérebro onde a informação é processada. Em Drosophila melanogaster e Anopheles gambiae, ORS são facilmente acessíveis e sua atividade elétrica pode ser monitorada enquanto estimulado por puffs odor.
A única técnica de gravação sensillum (SSR).......
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários | |
|---|---|---|---|---|
| Óleo de parafina | Odores | Fluka | 76235 | |
| Odores de alta pureza (>98%) | Odores | Sigma-Aldrich | Acetato de metila #296996 1-octen-3-ol #74950 | |
| Tiras de papel filtro | Odores | Fisher Scientific | 05-714-1 | Papel cromatográfico |
| Conectores | Odores | Cole-Parmer | EW-06365-40 | 1/16x1/8" |
| Frasco de vidro | Odores | Agilent Technologies | 5182-0556 | |
| Tubo plástico para linha de ar | Entrega de odor | Python Products | 500PAL | |
| 1 pipeta serológica | Entrega de odor | Corning | 4101 | 10 mL |
| Tubo plástico | Entrega de odor | Cole-Parmer | EW-06418-0 | 0,050"x0,090"OD |
| Pipetas Pasteur descartáveis de vidro borossilicato | Entrega de odor | Fisher Scientific | 13-678-20A | 5-3/4 polegadas |
| Controlador programável de estímulos | Entrega de odor | Syntech | CS-55 | |
| Mesa anti-vibração | Equipamento de eletrofisiologia | TMC | 63533 | 36”Lx30”Px29”A |
| Gaiola de Faraday | Equipamento de eletrofisiologia | TMC | MI8133303 | |
| Microscópio invertido | Equipamento de eletrofisiologia | Nikon Instruments | E600FN ECLIPSE | Microscópio de gravação |
| Objetivas de 10x e 100x | Equipamento de eletrofisiologia | Nikon Instruments | 10x Plan Fluor 100x L Plan | |
| Microscópio estereoscópico | Equipamento de eletrofisiologia | Nikon Instruments | EZ645 | microscópio para afiação de eletrodos/preparo de insetos |
| Suportes magnéticos | Equipamento de eletrofisiologia | Newport Corp. | MODEL 150 | |
| IDAC | Equipamento de eletrofisiologia | Syntech | IDAC-4 | |
| Software de aquisição | Equipamento de eletrofisiologia | Syntech | Autospike | |
| 1 macromanipulador | Equipamento de eletrofisiologia | Narishige International | MN-151 | Manipulador com joystick Usado para posicionar o eletrodo de referência |
| 1 micromanipulador | Equipamento de eletrofisiologia | EXFO | PCS-6000 | Usado para posicionar o eletrodo de gravação |
| Clipes de crocodilo | Equipamento de eletrofisiologia | Pomona | AL-B-12-0 | |
| Cabo elétrico | Equipamento de eletrofisiologia | Pomona | B-36-0 | Montagem de cabo de teste |
| 2 suportes de eletrodos | Equipamento de eletrofisiologia | Syntech | N/A | Suportes de eletrodos (conjunto de 2) para eletrodo de fio de tungstênio |
| Prova de CA | Equipamento de eletrofisiologia | Syntech | N/A | Prova universal de extremidade única (10xAC) |
| Eletrodos de tungstênio | Equipamento de eletrofisiologia | Microprobes | M210 | hastes retas de tungstênio, 0,005x3 |
| Hidróxido de potássio | Equipamento de eletrofisiologia | Sigma-Aldrich | 221473 | |
| Seringa | Equipamento de eletrofisiologia | BD Biosciences | 301625 | 20 mL |
| Fornecimento de energia | Equipamento de eletrofisiologia | Wild Heerbrugg | e.g MTR32 | |
| Puxador vertical | Preparo de insetos | Narishige International | PB-7 | |
| Lâmina de barbear | Preparo de insetos | VWR international | 55411-050 | |
| Cera dental | Preparo de insetos | Patterson | 091-1503 | |
| Lâmina de microscópio | Preparo de insetos | Fisher Scientific | 12-550A | |
| Cobertura de vidro | Preparo de insetos | Fisher Scientific | 12-541A | 18X18 #1,5 |
| Malha de polipropileno | Preparo de insetos | Small Parts, Inc. | CMP-0500-B | |
| Eletrodo de vidro | Preparo de insetos | Frederick Haer and Co. | 27-32-0-075 | Tubo capilar de borossilicato 1,5 mm OD x 1,12 mm ID x 75 mm |
| Fita adesiva dupla face (3M) | Preparo de insetos | 3M | MMM6652P3436 | Fita adesiva dupla face (3M) |
| Pinça | Preparo de insetos | Fine Science Tools | 021x0053 | Pinça espelhada Dumont #5 |
| Copo plástico pequeno | Preparo de insetos | VWR international | 89009-662 | 7 x 5,7 (23/4 x 21/4) |
| Aspirador elétrico | Preparo de insetos | Gempler’s | RHM200 |
Referências
- Boeckh, J. Elektrophysiologische Untersuchungen an einzelnen Geruchsrezeptoren auf der Antenne des TotengrAbers (Necrophorus Coleoptera). Z. Vergl. Physiol. 46, 212-248 (1962).
- Schneider, D., Hecker, E.
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Reimpressões e permissões
