Artigo de método

Fluxo multicolor de Citometria de Análises de resposta imune celular em macacos rhesus

DOI:

10.3791/1743

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22 de abril de 2010

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1Department of Immunology, MD Anderson Cancer Center - University of Texas, 2Department of Medicine, University of Miami

Neste artigo

Resumo

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Demonstramos a utilidade da multicolor citometria de fluxo para caracterização fenotípica e funcional detalhada do total, bem como subconjuntos memória de CD4 + e CD8 + T em macacos rhesus, o modelo ideal para estudos de HIV / AIDS vacina.

Resumo

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O modelo de macaco rhesus é atualmente o melhor modelo disponível para o HIV-AIDS com respeito à compreensão da patogênese, bem como para o desenvolvimento de vacinas e terapêutica

Protocolo

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Os procedimentos para a análise detalhada fenotípica e funcional do total, bem como subconjuntos de memória das células T pode ser dividido em quatro partes: 1) a preparação de células e estimulação antigênica, 2) coloração da superfície marcador, 3) coloração de citocinas intracelulares e 4) citometria de fluxo análises.

1. Preparação celular e estimulação antigênica

  1. Ambos os recém-isoladas, bem como crio-preservado células mononucleares do sangue periférico (PBMC) foram utilizados neste protocolo. O PBMC foram isoladas de amostras venosas heparinizado ou citratado sangue de macacos rhesus por sedimentação gradiente de densida....

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Agradecimentos

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Dr. Pramod Nehete e Sra. Bharti Nehete de sangue e amostras de PBMC macaco; Este trabalho foi parcialmente financiado com recursos do NIH AI 46969 conceder, e todos os meios de cultura de células foram produzidos pelo Laboratório Central de Mídia, que é financiado pelo NIH conceder CA 16672.

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Materiais

Solução e Buffers

  • Ficoll-Hypaque (Histopaquen-1077, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)
  • RPMI-1640 meio (HyClone laboratórios, Logan, UT)
  • Soro fetal bovino (FBS), (HyClone laboratórios, Logan, UT)
  • L-glutamina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)
  • Penicilina estreptomicina / (Invitrogen, Carlsbad, CA)
  • Trypan azul reagente (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)
  • 50 mM Tris, pH 8,6; filtrada e armazenar a 4 ° C
  • PBS Dulbecco (DPBS, Ca2/Mg2-free; Life Technologies, Rockville, MD)
  • Buffer de fluxo de lavagem: suplemento DPBS com 2% de SFB, armazenar a 4 ° C
  • BD Fixação Cytofix / Cytoperm / permeabilização Solution Kit (BD Biosciences, San Jose, CA)

Agentes de ativação

  • Forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)
  • Ionomicina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)
  • Co-estimulação mAb CD49d, clone 9F10 (BD Biosciences, San Jose, CA)
  • Afinidade de anticorpos purificados F (ab) 2 fragmentos de cabra anti-camundongo IgG (H + L) (Kierkegaard e Perry Laboratory, Gaithersburg, MD)
  • Agentes específicos de ativação poderia incluir piscinas peptídeo, único peptídeo ou proteína inteira

Secreção de inibidores de citocinas

  • Brefedin A (BFA, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)
  • Ligue Golgi pode ser usado alternativamente (BD Biosciences, San Jose, CA)

Anticorpos

  • Vivo / morto fixable aquática kit fluorescente mancha (Invitrogen, Carlsbad, CA)
  • CD3 PE-Cy7 (SP34-2), (BD Biosciences, San Jose, CA)
  • CD4 Pacific Blue (OKT4), (eBiosciences (San Diego, CA)
  • CD8 Alexa700 (RPA-T8), (BD Biosciences, San Jose, CA)
  • CD28-PerCP cy5.5 (L293), (BD Biosciences, San Jose, CA)
  • CD95 APC (DX2), (BD Biosciences, San Jose, CA)
  • IFN-FITC (B27), (BD Biosciences, San Jose, CA)
  • IL-2 PE (MQ1-17H12), (BD Biosciences, San Jose, CA)

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ogg, G. S. Quantitation of HIV-1-specific cytotoxic T lymphocytes and plasma load of viral RNA. Science. 279, 2103-2106 (1998).
  2. Borrow, P., Lewicki, H., Hahn, B. H., Shaw, G. M., Oldstone, M. B. Viru....

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