Análise da composição completa de paredes celulares das plantas (biomassa lignocelulósica) Parte I: A lignina

Resumo

Biomassa vegetal é um recurso de carbono neutro principais renováveis, que poderiam ser usados ​​para a produção de biocombustíveis. Biomassa vegetal consiste principalmente das paredes das células, um material estruturalmente complexo composto chamado lignocelulose. Aqui nós descrevemos um protocolo para uma análise abrangente do conteúdo e composição da lignina polifenólicos.

Resumo

A necessidade de renováveis, neutra de carbono, e matérias-primas sustentáveis ​​para a indústria e sociedade tornou-se uma das questões mais prementes para o século 21. Este reacendeu o interesse no uso de produtos vegetais como matérias-primas industriais para a produção de combustíveis líquidos para transporte

Protocolo

1. Isolamento da parede celular

1. Moer cerca de 60-70mg de ar ou liofilizados material vegetal com 5,5 milímetros esferas de aço inoxidável em um tubo de 2 ml Sarstedt tampa de rosca usando um iWall, um robô de moagem e distribuição (30 s). Uma alternativa não-robótica procedimento de baixo rendimento utilizando um moinho de bolas (retschmill) é apresentada na Parte II ^2.
2. Adicionar 1,5 ml de 70% de etanol aquoso para o material do solo dispensado, e vortex completamente.
3. Centrifugar a 10.000 rpm por 10 min para sedimentar o resíduo de álcool insolúveis.
4. Aspirar ou decantar o sobrenadante.
5. Adicionar 1,5 ml de solução de clorofórmio / metanol (1:1 v / v) ao resíduo do tubo e agitar cuidadosamente para ressuspender o sedimento.
6. Centrifugar a 10.000 rpm por 10 min e Aspirar ou decantar o sobrenadante.
7. Ressuspender pellet em 500 mL de acetona.
8. Evaporar o solvente com um fluxo de ar a 35 ° C até secar.
   Se necessário amostras secas podem ser armazenadas em temperatura ambiente até ulterior processamento.
9. Para iniciar a remoção do amido da amostra ressuspender o sedimento em 1,5 ml de sódio 0,1 M tampão acetato pH 5,0.
10. Cap os tubos Sarstedt e calor durante 20 min. a 80 ° C em um bloco de aquecimento.
11. Legal da suspensão sobre o gelo.
12. Adicionar os seguintes agentes para o pellet: 35 mL de 0,01% de azida de sódio (NaN3), 35 mL de amilase (50 mcg / mL H ₂ O, a partir de espécies de Bacillus, Sigma); 17 pululanase mL (17,8 unidades de acidopullulyticus Bacillus; Sigma) . Tampe o tubo e vortex completamente.
13. A suspensão é incubado durante a noite a 37 ° C no shaker. Orientar os tubos na horizontal assessores melhorou mistura.
14. Suspensão de calor a 100 ° C por 10 min em um bloco de aquecimento para terminar a digestão.
15. Centrifugação (10.000 rpm, 10 min) e descarte de amido contendo sobrenadante solubilizados.
16. Lave o pellet restantes três vezes pela adição de 1,5 ml de água, vortex, centrifugação, decantação e da água de lavagem.
17. Ressuspender pellet em 500 mL de acetona.
18. Evaporar o solvente com uma corrente de ar a 35 ° C até secar. Pode ser necessário também para quebrar o material no tubo com uma espátula para secar melhor.
    O material seco apresenta parede celular isolada (lignocelulose). Se necessário amostras secas podem ser armazenadas em temperatura ambiente até ulterior processamento.

2. Teor de lignina

Este método é baseado em um método relatado por Fukushima e Hatfield 3.

1. Pesar 1-1,5 mg de material preparado da parede celular (ver 1) para balão volumétrico de 2 ml deixando um tubo vazio para um em branco.
2. lavar paredes do tubo com 250 mL de acetona para recolher o material da parede celular na parte inferior do tubo, e evaporar a acetona muito gentil com fluxo de ar.
3. Delicadamente adicionar 100 ml de solução de brometo de acetila acabado de fazer (25% v / v brometo de acetila em ácido acético glacial) ao longo das paredes do tubo para evitar respingos.
4. Cap balão e aquecer a 50 ° C por 2 horas
5. Calor por uma hora adicional com vórtex a cada 15 minutos.
6. Fresco no gelo à temperatura ambiente.
7. Adicionar 400 mL de hidróxido de sódio 2M e 70 mL de recém-preparados 0,5 M cloridrato de hidroxilamina. Vortex frascos volumétricos.
8. Encher o balão volumétrico exatamente à 2,0 ml marca com ácido acético glacial, tampa e inverter várias vezes para misturar.
9. Pipeta de 200 mL da solução para um UV 96 placa específica bem e lido em um leitor de ELISA em 280nm.
10. Determinar a porcentagem de lignina solúvel em brometo de acetila (ABSL%), utilizando um coeficiente adequado (Poplar = 18,21; Gramas = 17,75; Arabidopsis = 15,69) com a seguinte fórmula:
    % ABSL Calc:
    
    Multiplicação de ABSL%, com 10 resultados na unidade de parede ug / mg de células
    
    Ele ajuda a fazer pelo menos 3 placa lê a média da absorbância (abs) desde partículas pode causar uma ligeira variação nos valores de absorbância. Nota: 0,539 centímetro representa a extensão de caminho, mas dependendo da placa esta pode ter de ser determinado.

3. Composição lignina

Este método é adotado a partir de um método recente publicado por Robinson e Mansfield ^5.

1. Transferir aproximadamente 2 mg de material de parede celular (ver 1.) Em um tubo de vidro tampado para thioacidolysis parafuso.
2. preparar cuidadosamente a 2,5% de boro trifluoreto dietil etherate (BF ^3), 10% etanotiol solução (EtSH). Você deve usar um balão cheio de gás nitrogênio para deslocar o volume perdido na garrafa dioxano com nitrogênio. Dioxano é muito perigoso, não tome amostras ou equipamento fora do capô. Volumes necessários para a preparação da solução por amostra: 175 mL dioxano, 20 EtSH mL, 5 mL BF ^3.
3. Adicionar 200 mL de EtSH, BF ^3, solução de dioxano para cada amostra.
4. Headspace Purge frasco com gás nitrogênio e tampa imediatamente.
5. Aquecer a 100 ° C por 4 horas com suave a cada hora de mistura.
6. Reação final de resfriamento em gelo por 5 minutos.
7. Adicionar 150 mL de bicarbonato de sódio 0.4M, vortex
8. Para o clean-up adicionar 1 ml de água e 0,5 ml de acetato de etila vórtice, e deixe fases distintas (acetato de etila na água superior, na parte inferior).
9. Transferência de 150 mL da camada de acetato de etila em um tubo de 2 ml Sarstedt. Certifique-se de falta de água é transferida.
10. Evaporar o solvente por um concentrador de ar.
11. Adicionar 200 mL de acetona e evaporar (repetir para um total de duas vezes remover o excesso de água).
12. Para a derivatização TMS adicionar 500 mL de acetato de etila, 20 l de piridina, e 100 l de N, O-bis (trimetilsilil) acetamida a cada tubo.
13. incubar por 2 horas a 25 ° C.
14. Transferência de 100 ul da reação em um frasco de GC / MS e adicione 100 ml de acetona.
15. Analisar as amostras por GC equipado com um espectrômetro de massa quadrupolar ou detector de ionização de chama. Uma coluna HP-Agilent 5MS está instalado (30 mm X 0,25 mm X 0,25 espessura de filme). O gradiente de temperatura a seguir é usado com um atraso de 30 min solvente e um caudal de 1,1 ml / min: segure inicial a 130 ° C por 3 min, uma rampa de 3 ° C / min até a 250 ° C e segure por 1 min; permitir equilíbrio com a temperatura inicial de 130 ° C.
16. Picos são identificados por tempos de retenção relativos usando tetracosano padrão interno (opcional) ou por íons de massa característica do espectro de 299 m / z, 269 m / z, e 239 monômeros m / z de S, G e H, respectivamente (ver fig. 2). A composição dos componentes da lignina é quantificado definindo a área do pico total para 100%

4. Resultados representante

Um exemplo de uma análise de parede é apresentado na Figura 2. Neste caso, álamo-tronco (madeira) foi analisada por vários procedimentos descritos na seção de protocolo. Um exemplo de cromatograma da separação de lignina-componentes após thioacidolysis e TMS derivatização é mostrado. Claramente, a abundância relativa de siringil (S), guaiacil (G), e p-hidroxifenol (H) unidades pode ser determinada. O conteúdo de lignina solúvel em brometo de acetila é auto-explicativo, pode-se esperar valores entre 20-50% do peso seco da parede. Deve-se notar que o brometo de acetila não solubilizar todos os presentes de lignina na parede, e que o grau de solubilização pode variar dependendo do material. No entanto, este método é relativamente fácil de realizar e rápida e dá uma excelente aproximação do teor de lignina em um material lignocelulósico.

Figura 1:. Muros Visão geral de análise lignocelulósicos Cell (lignocelulose) são isolados a partir de material vegetal bruto seco. O material da parede é então ponderado em alíquotas e subdividida para os ensaios diversos. Material da parede é tratado com brometo de acetila ea lignina solubilizada quantificados por espectroscopia de UV. Para a determinação da composição de lignina, material de parede é submetido a thioacidolysis. Os compostos fenólicos solubilizados sofrer derivatização TMS e pode então ser separados e quantificados por GC-MS análise. Da composição do polissacarídeo da matriz e protocolo de conteúdo cristalino da celulose é discutido na Parte II ^2.

Figura 2:. Fichas análise abrangente lignocelulósicos de madeira de álamo madeira de álamo (Populus tremoloides), foram submetidos aos protocolos descritos.
Ligin composição; H p-hidroxifenil; G guaiacil; unidades S siringil.

Discussão

Os métodos descritos permitem uma rápida avaliação quantitativa do teor de lignina e composição da biomassa vegetal lignocelulósica. Usando o robô iWall cerca de 350 amostras podem ser moídos e dispensados ​​por dia. O rendimento dos vários métodos analíticos por pessoa varia. Utilizando os protocolos descritos aqui, 30 amostras podem ser processadas para teor de lignina, e 15 para a composição de lignina por dia. Devido à natureza quantitativa das culturas de matérias-primas de dados ideal, variedade ou genótipos pode ser avaliada em termos de sua aptidão para a produção de biocombustível.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Cloridrato de hidroxilamina	Sigma-Aldrich	255580
Brometo de acetila	Aldrich	135968
Etanothiol	Sigma-Aldrich	E3708
Borontrifluoreto dietil éterato	Fluka	15719
N,O,-Bis(trimetilsilil) acetimida	Fluka	15241
Dioxano	Sigma-Aldrich	296309
Spectromax Plus 384	Molecular Devices	Plus384
GC-MS	Agilent Technologies	6890 GC/5975B MSD	(composição de lignina)
Bolas de aço inoxidável de 5,5mm	Salem Ball Company	(N/A)
Dissipador de calor de placa de 96 poços	Biocision	Coolsink 96F
Bloco de aquecimento	Techne	Concentrador de amostras Dri-block DB-3D
	Techne	FSC400D