Os autores não têm nada a declarar.

christopher hughes: um modelo in vitro para o estudo da angiogênese (entrevista)

Christopher Hughes:  An in vitro model for the Study of Angiogenesis (Interview)

Christopher CW Hughes descreve o utilitário de seu sistema de cultura para o estudo da angiogênese in vitro. Ele explica a importância de fibroblastos que secretam uma crítica, ainda não identificado fator, solúveis que permitem às células endoteliais para formar vasos na cultura que se ramificam, a forma adequada lumens, e passam por anastomose.

Christopher Hughes: Um modelo in vitro para o Estudo da angiogênese (Entrevista)

Christopher C.W. Hughes descreve a utilidade do seu sistema de cultura para o estudo da angiogênese in vitro. Ele explica a importância dos fibroblastos que ...

Olá, meu nome é Dr. Christopher Hughes. Sou professor na Universidade da Califórnia, em Irvine, e meu laboratório trabalha com angiogênese. Estamos particularmente interessados nos genes que regulam o processo de angiogênese.Otimizamos um ensaio in vitro baseado no trabalho de Nelson e, nesse ensaio, podemos observar todos os diferentes processos que ocorrem durante a angiogênese: revestimos microesferas com células endoteliais. Em seguida, incorporamos essas microesferas em géis de fibrina. Fornecemos fatores de crescimento.E ao longo de vários dias, as células endoteliais brotam dos grânulos. Elas migram, se alinham, proliferam, formam tubos, ramificam e criam anastomoses. Assim, por volta do décimo dia, temos uma rede capilar completa em cultura.Bem, alguns dos problemas com os ensaios *in vivo* e de angiogênese, por exemplo, aqueles realizados em camundongos, são que é muito difícil manipular o sistema. É difícil visualizar quando se tem esse processo ocorrendo dentro de um animal; você realmente não consegue ver a angiogênese acontecendo. E se você quiser manipular o sistema em nossos cultivos *in vitro*, é muito fácil manipular geneticamente as células endoteliais, ligar e desligar genes e observar os efeitos disso sobre a angiogênese em brotamento.E é muito mais difícil fazer isso no animal inteiro. É necessário criar knockouts ou knockins. Essas são as duas principais vantagens.É fácil manipular e fácil de visualizar. Ao longo dos anos, foram desenvolvidos diversos ensaios de agênese in vitro, cada um com suas vantagens e desvantagens. Em particular, um ensaio bem conhecido é o ensaio com gel de matriz, no qual células endoteliais são colocadas sobre uma matriz extracelular chamada matrigel.E o problema é que as células endoteliais formam estruturas semelhantes a cordões, mas nunca chegam a formar vasos verdadeiramente luminalizados. Você não observa brotamento, nem anastomose. Existem modelos com gel de colágeno, que podem ser bons.Há muitos desses em que não se observa a proliferação das células endoteliais. Normalmente, não se observa anastomose. O ensaio com gel de fibrina que desenvolvemos baseia-se em um modelo de Nelson Kar publicado em meados dos anos noventa.E agora aprimoramos drasticamente isso ao ponto de conseguirmos observar todas as fases da angiogênese. Podemos acompanhar o brotamento inicial, a migração. Vemos a proliferação de células, a formação de lúmen, obtemos ramificações e, finalmente, alcançamos a anastomose para formar uma rede vascular completa in vitro.Assim, acreditamos que este ensaio seja realmente o melhor sistema in vitro disponível se você deseja analisar todas aquelas diferentes fases da angiogênese. Outra vantagem que temos com este ensaio in vitro é que podemos realizar a captura a laser com microdissecção; podemos centrifugar o cultivo para torná-lo bem plano e, em seguida, utilizar o microscópio de microdissecção com captura a laser. Na verdade, podemos isolar células individuais, sendo que estamos particularmente interessados nas células de ponta.E então estamos removendo essas estruturas para analisar a expressão gênica, particularmente nas células das pontas em comparação com as células do tronco, ou seja, as células que realmente formam o lúmen. Nossa hipótese é que haverá expressão gênica diferencial entre essas duas populações celulares. Podemos investigar isso, o que seria praticamente impossível de realizar em um sistema in vivo.Por isso, acreditamos que essa é outra grande vantagem do uso deste ensaio in vitro. Os primeiros trabalhos realizados nesse campo, como mencionei por Nelson Recon, utilizaram células endoteliais microvasculares. E há um grande consenso de que as células endoteliais microvasculares são as células que se deseja utilizar em um ensaio como este, pois in vivo são as EC microvasculares que realmente formam novos vasos.Decidimos tentar fazer isso com ve. Essas são células endoteliais de veia umbilical humana por várias razões. Uma delas é que essas células são muito fáceis de obter.Você pode ir ao hospital, pode obter cordões umbilicais das salas de parto e pode isolar as células de maneira muito fácil. Além disso, essas células vêm sendo usadas em cultura há muitos anos. Elas são muito bem caracterizadas.E então montamos este ensaio e o otimizamos para que pudéssemos usar essas células por essas razões. E, curiosamente, verifica-se que as vex, essas células endoteliais de grandes vasos, parecem assumir a forma de células endoteliais microvasculares em cultura. Elas perdem muitos genes normalmente expressos por ec de grandes vasos e começam a expressar genes normalmente associados a células endoteliais microvasculares.E eles são perfeitamente capazes de formar brotos semelhantes a capilares, criar lúmens e produzir estruturas que, em cultura, se assemelham a capilares reais. Portanto, são fáceis de usar, ve são fáceis de usar, e realizam o que desejamos que façam. Eles brotam e formam vasos adequadamente aluminalizados.Quando queremos quantificar este ensaio, existem realmente algumas maneiras de fazê-lo. Podemos analisar critérios realmente quantitativos, como o número de brotos, o comprimento dos brotos, o diâmetro dos brotos, o número de pontos de ramificação e o número de anastomoses, mas também podemos considerar critérios qualitativos. Assim, podemos verificar se eles estão formando lúmens?E isso é provavelmente o que mais nos interessa. Em muitos dos ensaios que realizamos, está a formação adequada da luz. E isso é realmente uma avaliação mais qualitativa, embora, à medida que os vasos aumentam de tamanho, seja possível medir também o diâmetro dessas luzes.Então, utilizamos fibroblastos nessas culturas. Incorporamos as esferas ao gel de fibrina e semeamos fibroblastos sobre o gel. Os fibroblastos são absolutamente essenciais para a formação adequada de brotos e de lúmen.Na ausência de fibroblastos, observamos algum brotamento. No entanto, as células endoteliais tendem a não permanecer aderidas umas às outras. O que acontece é que elas migram separando-se. E assim, qualquer estrutura que você estiver desenvolvendo neste broto tende a se desfazer. E após alguns dias, as células endoteliais entram em apoptose. Portanto, parece que os fibroblastos produzem fatores essenciais para a angiogênese, pelo menos neste sistema in vitro.E temos tido grande interesse em descobrir quais são esses fatores. O que descobrimos é que os fibroblastos secretam algo no meio, de modo que podemos coletar o meio condicionado dos fibroblastos e esse meio será capaz de sustentar a brotação adequada e a formação de lúmen. Portanto, estamos claramente lidando com um fator solúvel.É evidente que estamos muito interessados em saber o que os fibroblastos estão produzindo que é tão importante para a angiogênese neste sistema. Testamos todos os suspeitos habituais: VEGF, FGF básico está presente no cultivo, mas adicionar mais não substitui os fibroblastos. Também testamos angiopoietina 1, TGF-beta, HGF, entre outros.Até agora não identificamos o fator essencial. O que estamos fazendo agora é purificar fatores do meio condicionado de fibroblastos. Estamos aplicando o meio condicionado em várias colunas, de troca catiônica, exclusão por tamanho, e obtendo frações que apresentam atividade.E agora estamos acompanhando essa atividade e coletando essas frações, identificando quais são ativas, e a partir daí podemos analisá-las em géis, garantir que tenhamos apenas um número relativamente pequeno de bandas no gel e, então, podemos recortá-las e enviá-las para sequenciamento por espectrometria de massas. E isso tem nos proporcionado muitos dias bastante interessantes. Atualmente, temos vários genes candidatos que estão sendo testados individualmente para verificar se são realmente o fator que estamos procurando.Portanto, testamos diversos fatores angiogênicos conhecidos e descobrimos que o VEGF e o FGF básico são essenciais para a brotamento adequado neste ensaio. No entanto, eles não explicam toda a história. Existem fatores derivados que são importantes, como mencionei, e uma maneira pela qual investigamos isso foi utilizando células tumorais, que são altamente angiogênicas in vivo, geram tumores grandes em camundongos e são altamente vascularizadas.E examinamos essas células tumorais e observamos que elas expressam níveis muito elevados de VEGF, os quais introduzimos em nossas culturas. Assim, substituímos os fibroblastos por essas células tumorais e elas não sustentam uma angiogênese robusta neste ensaio. E isso é muito interessante.O que isso sugere, e o que também já foi sugerido por outras pessoas, é que existe uma comunicação cruzada entre o tumor, o estroma, que são os fibroblastos e outras células de suporte no tecido, e as células endoteliais. E pode muito bem ser que as células tumorais produzam alguns fatores que atuam diretamente sobre as células endoteliais, mas elas também produzem outros que estimulam os fibroblastos e outras células estromais a produzirem fatores que, por sua vez, também apoiam uma angiogênese robusta.

christopher-hughes-an-vitro-model-for-study-angiogenesis

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

University of California, Irvine (UCI).  Christopher CW Hughes descreve o utilitário de seu sistema de cultura para o estudo da angiogênese in vitro. Ele explica a importância de fibroblastos que secretam uma crítica, ainda não identificado fator, solúveis que permitem às células endoteliais para formar vasos na cultura que se ramificam, a forma adequada lumens, e passam por anastomose.

Christopher Hughes: Um modelo in vitro para o Estudo da angiogênese (Entrevista)

Neste artigo

Resumo

Resumo

Divulgações

Reimpressões e permissões

Etiquetas