Este vídeo demonstra um método para dissecar e cultura de neurônios comissurais E13 rato medula espinhal dorsal. Dissociada neurônios comissurais são úteis para estudar os mecanismos celulares e moleculares do crescimento do axônio e orientação.
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Artigo de método
Dissecção e Cultura de Neurônios da Medula Espinhal comissural embrionárias
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Neurônios comissurais têm sido amplamente utilizados para investigar os mecanismos subjacentes a orientação dos axônios durante o desenvolvimento embrionário medula espinhal. Os corpos celulares desses neurônios estão localizados na medula espinhal dorsal e seus axônios seguem trajetórias estereotipados durante o desenvolvimento embrionário. Axônios comissurais inicialmente para o projeto ventralmente floorplate. Depois de cruzar a linha média, esses axônios vez anteriormente e projeto para o cérebro. Cada uma dessas etapas é regulado pela ação de várias pistas de orientação. Culturas altamente enriquecido em neurônios comissurais são ideais para muitas experiências abordando os mecanismos de pathfinding axônio, incluindo ensaios de torneamento, imunoquímica e bioquímica. Aqui, nós descrevemos um método para dissecar e cultura de neurônios comissurais E13 rato medula espinhal dorsal. Em primeiro lugar, a medula espinhal é isolado e tiras dorsal são dissecados. O tecido é então dissociado dorsal em uma suspensão de células por tripsinização e perturbação mecânica. Neurônios são banhados em lamínulas poli-L-lisina-revestido de vidro ou de cultura de tecidos de pratos. Após 30 horas
Protocolo
1. Dissecção da medula espinhal dorsal embrionárias de rato
Recomendações gerais
Mantenha L-15 médio no gelo e muitas vezes mudar o meio no prato dissecção para manter os embriões frescos. Isso ajuda a preservar a integridade dos tecidos. Todas as etapas são realizadas com duas pinças Dumont # 5 a menos que indicado. Para evitar a contaminação, spray todas as ferramentas e superfícies de trabalho com etanol 70% e manter a garrafa meio dissecção fechado. A transferência de embriões entre pratos, use uma pipeta de plástico recortado ou uma colher perfurada. É fundamental para não danificar a medula espinhal (nicking,....
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Discussão
Nós descrevemos um método para dissecar e cultura neurônios comissurais do cordão espinhal de ratos embrionárias. Este procedimento tem sido utilizado rotineiramente em nosso laboratório para preparar os neurônios de forma confiável para estudar os mecanismos celulares e moleculares de orientação axônio. Para a biologia celular e experimentos imunoquímica, a dissecção de uma ninhada produz neurônios suficientes. Quando as células são mais necessários, como em muitos experimentos de bioquímica, dissecção de duas ninhadas.......
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Agradecimentos
Este trabalho foi financiado por concessões do Canadian Institutes of Health Research (CIHR), o Peter Lougheed Medical Research Foundation, o Programa de McGill em Neuroengenharia, o Fonds de Recherche en Santé du Québec (FRSQ), ea Fundação Canadense para Inovação (CFI ). Sébastien D. Langlois foi apoiada pelo Prêmio de Mestre de Formação do Fonds de la Recherche en santé du Québec (FRSQ) e Frederick Banting por Charles e Prêmio de Melhor Canadá de Pós-Graduação Mestrado Bolsas de Estudo a partir do Canadian Institutes of Health Research (CIHR). Somos gratos a Jessica MT Pham de assistência com os números.
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Materiais
Dissecção da medula espinhal dorsal embrionárias de rato (ver também Quadro I)
- E13 gravidez encenado rato
- Etanol 70%
- Tesoura cirúrgica, Ferramentas Ciência Belas
- Fórceps, Dumont # 5, Ferramentas Ciência Belas
- Placas de Petri
- L-15 de médio
- Microscópio de dissecção, Leica
- Plástico pipetas de transferência
- Microtesoura, Ferramentas Ciência Belas
- Agulhas de tungstênio e retentores de pinos (uma agulha em forma de gancho, uma agulha L-formas, uma agulha), Ferramentas da Ciência Belas
- Inativado pelo calor soro de cavalo (HiHS)
- 15 ml de tubos de plástico
Comissural neurônio cultura (ver também Quadro I)
- Tecido incubadoras cultura (37 ° C, umidade 5% CO 2, controlada)
- Alemão Desag lamínulas de vidro e / ou placas de cultura de tecido de plástico
- Poli-L-lisina, Sigma
- Estéril MilliQ H 2 O
- Neurobasal, Invitrogen
- Inativado pelo calor soro fetal bovino (HiFBS)
- L-Glutamina
- B27, Invitrogen
- Penicilina / estreptomicina antibióticos
- Banho-maria 37 ° C
- Pasteur estéril Pipettes
- Bunsen queimador de gás
- HBSS, Ca 2 + / Mg 2 + livre, Invitrogen
- DNAse, Worthington
- MgSO 4
- Centrifugador
- Hemocitômetro
- Solução Azul Trypan
Referências
- Charron, F., Stein, E., Jeong, J., McMahon, A. P., Tessier-Lavigne, M. The morphogen sonic hedgehog is an axonal chemoattractant that collaborates with netrin-1 in midline axon guidance. Cell. , 113-1111 (2003).
- Fabre, P., Shimogori, T., Charron, F.
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Reimpressões e permissões
