Otimizado de fibrina Gel Assay Bead para o Estudo da angiogênese

Resumo

Este vídeo demonstra o protocolo de um ensaio in vitro angiogênese que recapitula vários estágios de angiogênese. Lapso de tempo imagens de germinação, formação de lúmen, ramificação e anastomose - características-chave da angiogênese - são mostrados.

Resumo

A angiogênese é um processo de várias etapas complexas, onde, em resposta a estímulos angiogênicos, novos vasos são criados a partir da vasculatura existente. Estes passos incluem: degradação da membrana basal a proliferação e migração (sprouting) das células endoteliais (CE) na matriz extracelular, o alinhamento da CE em cordas, ramificação, formação de lúmen, a anastomose, e formação de uma nova membrana basal. Muitos ensaios in vitro têm sido desenvolvidos para estudar este processo, mas a maioria apenas imitar determinadas fases da angiogênese, e morfologicamente os vasos dentro dos ensaios muitas vezes não se assemelham a vasos in vivo. Baseado em trabalhos anteriores por Nehls e Drenckhahn, temos otimizado um ensaio in vitro que utiliza a angiogênese umbilical humano veia CE e fibroblastos. Este modelo recapitula todas as etapas chave no início da angiogênese e, sobretudo, os vasos mostrar patente lumens intercelular cercado por CE polarizada. CE são revestidos em microcarregadores Cytodex e incorporados em um gel de fibrina. Os fibroblastos são camadas em cima do gel, onde eles fornecem necessárias fatores solúveis que promovem CE brotando da superfície das esferas. Depois de vários dias, numerosos vasos estão presentes que podem ser facilmente observado sob contraste de fase e microscopia de lapso de tempo. Este vídeo demonstra os passos-chave na criação dessas culturas.

Protocolo

CÉLULAS PREPARAÇÃO

1. Trazer HUVEC e fibroblastos em M199/10% FBS / Pen-Strep (1:100) 1-2 dias antes beading.
2. Interruptor de médio a EGM-2 (CLONETICS) no dia anterior beading para HUVEC e no dia anterior a incorporação de fibroblastos.
3. A concentração de ~ 400 HUVEC por talão é necessário.
4. 20.000 fibroblastos por poço é necessário.

REVESTIMENTO as contas com HUVEC - -1 dia

1. Trypsinize HUVEC.
2. Permitir contas para resolver (Não centrifugar!). Aspirar o sobrenadante e lavar as contas brevemente em 1 mL de meio de EGM-2 quente.
3. Mix contas 2500 w / 1X10 ⁶ HUVEC em 1,5 mL de meio de EGM-2 quente em um tubo FACS. Colocá-lo na vertical na incubadora. (Isso será suficiente para ~ 10 poços. Scale up se necessário)
4. Incubar por 4 horas a 37 ° C, agitando o tubo a cada 20 minutos. (Revestimento Bom é crucial para a brotação.)
5. Após 4 horas, as contas de transferência para um balão revestido T25 em 5 mL de EGM-2 e deixar S / N.

Incorporação BEADS REVESTIDO EM GEL fibrina - DIA 0

1. Preparar a solução de fibrinogênio 2,0 mg / mL (Ver secção receita).
2. Adicionar 0,15 Unidades / mL de aprotinina para a solução de fibrinogênio.
3. Transferência de contas revestida para um tubo cônico 15mL e deixe grânulos resolver. Contas ressuspender em 1 ml de EGM-2 e transferir para um tubo de centrifugação 1,5 ml.
4. Lave as contas 3X com 1mL de EGM-2 por pipetagem para cima e para baixo lentamente.
5. Contagem de contas em uma lamela e ressuspender em solução de fibrinogênio em uma concentração de aproximadamente 500 contas / mL.
6. Adicionar 0,625 Unidades / mL de trombina em cada poço.
7. Adicionar 0,5 mL da suspensão de fibrinogênio / talão para cada poço de uma placa de 24 poços.
   
   Alterar a ponta da pipeta para cada poço!
   
   
8. Misture a trombina eo fibrinogênio por subir e descer suavemente com a ponta da pipeta ~ 4-5 vezes. Tenha cuidado para não fazer bolhas grandes.
9. Deixar a placa por 5 min na capa, em seguida, colocá-lo na 37 ° C-incubadora por 10-15 min para gerar um coágulo.
10. Enquanto espera para o coágulo, trypsinize fibroblastos.
11. Adicionar 1 mL da EGM-2 por poço queda sábio.
12. Fibroblastos de sementes em cima de fibrina gel em uma concentração de 20.000 células por poço.

NOTAS:

Normalmente, quando o gel de fibrina é formada, você verá pequenas bolhas no gel. Não se preocupe, eles vão desaparecer em 3-4 dias.

Troque a mídia todos os dias, ou seja, Dia 2, 4, 6, etc ..

De dia 3 ou 4, você deve começar a ver a germinação.

Discussão

Há um consenso crescente de que em três dimensões (3D) em ensaios de angiogênese in vitro oferecer um modelo que é muito mais próximo do ambiente real in vivo do que pode ser conseguido usando culturas 2D. É evidente que sistemas 3D superiores deve ser reprodutível, e ser capaz de imitar vários dos principais passos da angiogênese. Apesar de vários ensaios anteriores 3D têm sido desenvolvidos, muitos destes usar difíceis de obter células microvascular, ou apenas recapitular algumas das etapas. Neste vídeo, descrevemos e realizar um ensaio i...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Esferas Cytodex-3	Reagente	Amersham	17-0485-01	10 g/frasco. 1.0,5 g de esferas secas são hidratadas e inchadas em 50 mL de PBS (pH = 7,4) por pelo menos 3 h à temperatura ambiente (RT). Use um tubo de 50 mL e coloque-o no agitador orbital. 2. Deixe as esferas sedimentarem (~15 min). Descarte o sobrenadante e lave as esferas por alguns minutos em PBS fresco (50 mL). 3. Descarte o PBS e substitua por PBS fresco: 25 mL -> 20 mg/mL => 60000 esferas/mL ou 50 mL -> 10 mg/mL => 30.000 esferas/mL. 4. Coloque a suspensão de esferas em um frasco de vidro silanizado (Windshield Wiper ou Sigmacote). 5. Esterilize as esferas por autoclavagem por 15 min a 115°C. 6. Armazene a 4°C.
Aprotinina	Reagente	Sigma-Aldrich	A-1153	10 mg/frasco. Reconstitua a aprotinina liofilizada a 4 U/mL em água desionizada (DI). Filtre esterilizando. Faça alíquotas de 1 mL cada. Armazene a -20 °C.
Fibrinogênio Tipo I	Reagente	Sigma-Aldrich	F-8630	1 g. Dissolva o fibrinogênio a 2 mg/mL em DPBS. Observar a porcentagem de proteína coagulável e ajustar conforme necessário. Aqueça em banho-maria a 37 °C para dissolver o fibrinogênio. Misture invertendo o tubo. Não vortex. Filtre esterilizando através de filtro de 0,22 µm.
Trombina	Reagente	Sigma-Aldrich	T-3399	22 mg = 1.000 unidades. Reconstitua em água estéril a 50 U/mL. Faça alíquotas de 0,5 mL cada. Armazene a -20 °C.