Method Article

Análise do desenvolvimento de um fenótipo morfológico como uma função da concentração de proteínas em levedura de brotamento

DOI:

10.3791/1863

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March 24th, 2010

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1Department of Biological Sciences and Purdue Center for Cancer Research, Purdue University

In This Article

Summary

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Deleção do gene e superexpressão da proteína são métodos comuns para o estudo funções das proteínas. Neste artigo, descrevemos um protocolo para análise do desenvolvimento do fenótipo como uma função da concentração de proteína na população e de uma única célula em níveis Saccharomyces cerevisiae.

Abstract

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Deleção do gene e superexpressão da proteína são métodos comuns para o estudo funções das proteínas. Neste artigo, descrevemos um protocolo para análise do desenvolvimento do fenótipo como uma função da concentração de proteína na população e de uma única célula em níveis

Protocol

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A. Cultura de Células e indução de proteínas

Esta seção descreve as condições de cultura celular, ciclo celular sincronização com Nocodazol, seguida de indução da expressão da proteína a partir de um promotor regulável em células de levedura.

  1. A cepa de levedura tipo selvagem W303 (leu2-3, 112 trp1-1 CAN1-100 ura3-1 ade2-1 his3-11, 15) é transformada com cópia de alta (2μ) DNA plasmídeo que contém o nosso gene de interesse (ENTH2) sob o controle de um promotor de metionina-repressor (MET25). 2mM metionina é suficiente para suprimir a atividade do promotor, enquanto a mídia sem metionina permite a expressão máxi....

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Discussion

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Este protocolo descreve como monitorar o desenvolvimento de um fenótipo morfológico (célula de levedura capaz de se submeter a divisão celular propriamente dita) sobre superexpressão da proteína. Ao fazer este procedimento é importante para se lembrar de colher células de levedura por peletização na velocidade de centrifugação recomendada como velocidades mais rápidas podem danificar as células e os resultados obscuros. Azul de metileno e calcofluor branco deve ser adicionado ao vivo células pouco antes de imagens como .......

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Acknowledgements

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Agradecemos a Brian G. Coon e Claudia B. Hanna para discussões úteis e de apoio. Este projecto foi apoiado pelo start-up fundos do Dep. de Ciências Biológicas, da Universidade Purdue de Claudio R. Aguilar e um American Cancer Society Research Grant Institucional de Claudio R. Aguilar através do Centro de Câncer Purdue.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Reagente NocodazolSigma-AldrichM1404
Azul de Metileno 1% (p/v)ReagenteVWR internacionalVW6276-0
Calcofluor Reagente BrancoSigma-AldrichF3543
Reagente de VaselinaVWR internacionalVW3339-2

References

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  1. Rönicke, V., Graulich, W., Mumberg, D., Müller, R., Funk, M. Use of conditional promoters for expression of heterologous proteins in Saccharomyces cerevisiae. Methods Enzymol. 283, 313-322 (1997).
  2. Gietz, R. D., Woods, R. A.

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Protein ConcentrationMorphological PhenotypeBudding YeastWestern BlottingMicroscopy AnalysisTime Lapse VideoSeptin MislocalizationCell Division DefectMethionine Repressible PromoterAgrose Bed Preparation

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