Microdissecção a laser Aplicada ao perfil de expressão gênica de subconjunto de células a partir do Drosophila Asa Disco

Resumo

Microdissecção a laser foi aplicado para analisar perfil de expressão gênica em compartimentos específicos de Drosophila disco asa submetido a RNAi localizada In vivo. RNA extraído de áreas equivalentes de compartimentos silenciadas e unsilenced foi analisado por RT-PCR quantitativa para determinar perfis de expressão gênica comparativa no contexto da microecologia tecido nativo.

Resumo

Heterogeneidade de tecidos tem provado ser um fator limitante na quantidade de informações que podem ser gerados a partir de amostras biológicas, comprometendo análises a jusante. Considerando-se as associações complexas e dinâmicas celulares existentes dentro muitos tecidos, a fim de recapitular a nas interações vivo análise minuciosa molecular é preciso ser capaz de analisar populações de células específicas dentro de seu contexto nativo. Laser mediada por microdissecção pode alcançar este objetivo, permitindo uma identificação inequívoca e colheita bem-sucedida de células de interesse sob visualização microscópica direta, mantendo a integridade molecular. Temos aplicado esta tecnologia para analisar a expressão de gene dentro das áreas definidas do desenvolvimento de Drosophila disco asa, o que representa um sistema modelo para estudar vantajoso controlar o crescimento, diferenciação celular e organogênese. Larval discos imaginais são precocemente subdividida em compartimentos anterior e posterior, dorsal e ventral por fronteiras restrição linhagem. Fazendo uso da induzível GAL4-UAS sistema de expressão de binário, cada um desses compartimentos podem ser rotulados especificamente em moscas transgênicos expressando um transgene UAS-GFP sob o controle do driver apropriado GAL4 construir. Nos discos transgênicos, perfil de expressão gênica de subconjuntos discretos de células pode ser determinada precisamente após laser-mediada microdissecção, usando o sinal fluorescente GFP para guia de corte a laser.

Entre a variedade de aplicações a jusante, nos concentramos em RNA perfil transcrição localizada após interferência de RNA (RNAi). Com o advento da tecnologia de RNAi, GFP rotulagem podem ser acoplados com knockdown localizada de um determinado gene, o que permite determinar a resposta transcricional de uma população de células discretas para o silenciamento de genes específicos. Para validar esta abordagem, dissecamos áreas equivalentes do disco do posterior (rotulada pela expressão GFP), eo compartimento (sem identificação) anterior ao silenciamento regionais no compartimento de P de um gene de outra forma ubiquitously expressa. RNA foi extraído de microdissecção áreas silenciadas e unsilenced e perfil de expressão gênica comparativa determinado pelo quantitativo em tempo real, RT-PCR. Nós mostramos que este método pode ser aplicado de forma eficaz para transcriptômica precisa de subconjuntos de células dentro dos discos Drosophila imaginal. De fato, enquanto a preparação do disco massivo como fonte de RNA geralmente assume homogeneidade celular, é bem sabido que a expressão transcricional pode variar muito dentro dessas estruturas em conseqüência da informação posicional. Usando o sinal fluorescente GFP localizada a guia de corte a laser, mais precisas análises de transcrição pode ser realizada e rentável aplicado a diferentes aplicativos, incluindo perfis de transcrição de linhagens celulares distintas dentro de seu contexto nativo.

Protocolo

Parte 1. Preparação de discos Drosophila Asa Imaginal Sujeitos a RNAi específica e localizada.

Como material biológico, foram utilizados discos de Drosophila asa imaginal obtido a partir de larvas transgênicas submetidas ao silenciamento de genes localizados e específicos, por meio do sistema GAL4/UAS ^1. Esta progênie larval orginates de um cruzamento genético envolvendo duas linhas parentais: uma carregando o driver GAL4, o segundo a responder UAS. Além de expressar GAL4 no padrão temporal específica e / ou espacial, a linha do driver carrega um repórter UAS-GFP, que permite visualizar a expressão de domínio GA....

Discussão

Em relação aos seus níveis de expressão basal alcançado nos compartimentos anterior / posterior da asa unsilenced discos, a atividade do gene X selecionada foi encontrado reduzidos para 40% sobre o silenciamento. Em contraste, um dos seus alvos putativos (genes Y) foi encontrada significativamente sobre-regulada (7 vezes maior), levando-nos para validar a hipótese de que ela foi regulada negativamente pelo gene X.

Concluímos que a abordagem acima descrita experimental pode ser aplicado com s.......

Materiais

Fly cepas

Drosophila UAS silenciando-linhas podem ser obtidas VDRC RNAi coleção de ^2. Uma coleção de GAL4 driver-linhas está disponível no Drosophila Bloomington stock Center (Indiana, EUA).

Equipamento

Equipamentos necessários inclui Laser microdissector (Leica LMD6000), Coulter Microcentrifugue 22R (Beckman), PCR (BIO-RAD My Cycler), Real Time PCR (BIO-RAD iQ5).

Ferramentas

Ferramentas necessárias incluem: poços de vidro, escova, pinça de microdissecção, slides gotas de suspensão, alfinetes de insetos montados em agulhas de seringa, armações de metal com membrana PET, tubos de plástico (50 ml, 05 ml, 0,25 ml).