Summary
우리는 포유 동물 세포에서 생합성 후 glycoproteins의 초기 생활을 통해 N - 연결 glycans의 변조 분석을위한 방법을 설명합니다. 이것은 metabolically 표시 glycans, glycoproteins와 HPLC에 의해 시험에서 효소 릴리스의 펄스 체이스 분석에 의해 이루어진다.
Abstract
Glc의 첨부 파일
Protocol
다음 프로토콜은 총 glycoproteins이나 관심의 특정 당단백질의 설탕 체인 분석위한 것입니다. 프로 시저는 기본적으로 프로토콜을 통해 언급한 몇 가지 변경 사항과 함께 두 경우 모두에 대해 동일합니다.
- N - 연결 glycans의 대사 라벨링을 위해 각 샘플에 대해 90mm 접시에 밤새 자란 포유 동물 세포의 subconfluent 문화를 사용하는 한 요구 (샘플 서로 다른 시간 지점이나 트리 트먼트를 나타내는 수 있습니다.) 이 프로토콜은 NIH 3T3 세포에 최적화되어 있습니다.
- 10% dialyzed FCS와 5-15분 4 MM 나트륨 pyruvate와 함께 제공된 신선한 사전 예열 (37 ° C) 포도당없는 매체, 5 ML에서 부화하여 포도당에 대한 세포를 굶어.
- 사전 예열 1 ML과 기아 매체를 교체 (37 ° C) 포도당 무료 400 μCi가 포함된 매체 [2 - 3 H] (낮은 65 농도 μCi / ML은 총 glycoproteins의 라벨에 사용됩니다) mannose - 라벨, 1 시간 동안 정상적인 조직 문화 조건에서 세포를 품어.
- 각 샘플의 라벨 미디어를 제거하고, 신중하게 4 PBS 2 ML을 추가 ° 추적에 해당하는 샘플을 필요로하는 동안 맥박과 얼음 (이 샘플 펄스라고도합니다) 그들을 장소에 해당하는 샘플을 C, 2 ML 3 번 씻어서 미리 예열 (37 ° C) 정상 완료 배지, 그리고 37 CO 2 배양기에 배치 ° C 원하는 추적 기간 동안 미리 예열 정규 매체의 5 ML과 함께.
- 얼음처럼 차가운 PBS 2 ML과 펄스 샘플 (이전 얼음에 위치) 3 번 린스. 세포는 다음 셀 스크레이퍼를 사용하여 두 ML PBS에서 요리를 긁어 냈어요, 그리고 2 ML Eppendorf 튜브에 배치됩니다.
- 16000Xg (60-10 초)에있는 세포 단기 스핀, 표면에 뜨는를 버리고 -80에서 세포 펠릿 ° C.를 동결
- 단계 5 체이스 시간의 끝에 추적 샘플에도 6 수행합니다.
- 냉동실에서 세포를 제거하고 버퍼 300 μl를 추가하여 그들을 lyse은 잠시을 vortexing하고 부화하여 버퍼 B와 함께 얼음에 20 분 얼음 20 분 잠복기, 또는 총 glycoproteins 분석의 경우, sonication 다음 (4 회, 10 초, 최대 진폭), 다음 5 분에 대한 샘플을 끓여.
- 4 ° C. 20 분 16000Xg에서 lysates을 원심 분리기 새로운 Eppendorf 튜브에 뜨는을 전송하여 펠렛을 삭제.
- 총 glycoproteins를 분석하면, 분자 여과 및 deglycosylation (단계 17)로 진행합니다. H2a의 당단백질의 immunoprecipitation 여기 시연에 대한 (우리의 예를 들어 안티 H2a 항체에 (Repligen) 단백질 A - 아가로 오스 비즈 1시 1분 정지하고 원하는 당단백질를위한 토끼 polyclonal 방지 H2a 항체 3 μl / 샘플 20l/sample을 추가 ), 9 단계에서 뜨는 있습니다.
- 지속적으로 속도가 느린 회전에 의해 혼합, 4 ° C에서 4-16시간에 대한 샘플을 품어.
- 30 초 동안 16000Xg에서 비즈를 스핀 다운, 그리고 신중하게 뜨는 사용하여 진공을 제거합니다.
- 500 μl 버퍼 D를 추가하고 vortexing하여 구슬을 씻어. 12 단계에서와 같이 회전하여 표면에 뜨는를 제거합니다. 세차 3 회 반복합니다.
- 비드 펠렛에 10μl denaturing 버퍼 (코 엔도 - H 키트와 함께 제공되는) 추가하고 5 분 (총 단백질을 분석하는 경우, deglycosylation가 Microcon 필터 단계 17을 수행합니다)에 대한 샘플을 끓여.
- (30 초 동안 16000Xg) 비즈를 스핀 다운, 새로운 Eppendorf 튜브에 뜨는를 전송합니다. 다음 엔도 H 효소의 0.5μl는 반응 버퍼 (도 코 엔도 H 키트와 함께 제공) 10 μl와 함께 각각의 샘플에 추가되며, 샘플은 3 시간 동안 ° C 37 incubated 수 있습니다.
- 단백질에서 릴리스된 glycans을 분리하려면 샘플은 다음 3 분 14000Xg에 centrifuged, 컷 - 오프 30kDa와 탈이온수 5 번 희석 및 분자 필터 (Microcon Ultracel YM30)의 상단에 위치합니다. 탈이온수 및 샘플 반복 원심 분리의 50μl을 적용합니다. 이 워시 아웃은 흐름을 통해 유지, 2 번 더 반복합니다.
- 당신이 총 glycoproteins을 분석하는 경우 Microcon 필터에 lysates의 뜨는을 (9 단계에서) 적용됩니다. 3 분위한 14000Xg에서 반복 원심 분리하여 3 번 버퍼 E, 100 μl로 추출 씻으십시오. 10X 엔도 H 반응 버퍼 3 μl와 Microcon retentate에 엔도 H 효소 1.5 μl를 추가하고, 37 3 시간 동안 품어 ° C. 공개 glycans는 단계 16로 3 반복 centrifugations의 탈이온수와 eluted 있습니다.
- 원하는 경우, 엔도 H 방지 glycoproteins를 포함하는 단계를 16 17 retentates은 다음 37, 버퍼 C 15 μl에 N - glycosidase F 조의 200mU와 incubated 아르 ° C를 16 H.위한 탈이온수과 용출은 단계 16로 이루어집니다.
- SpeedVac 농축기에서 엔도 H 반응 흐름을 통해이 (단계 16 17)가 들어있는 튜브를 배치그리고 완전히 샘플을 건조 (이것은 45까지 할 수있는 ° C는이 과정을 가속).
- HPLC에 대한 샘플을 준비하려면, HPLC 용매 (물, 60:40, 1 %의 인산 acetonitrile) 12 μl의 건조 알약을 resuspend.
- 상수 용매의 흐름 (1 ML / 분)와 압력 (1000 2000 PSI 사이의 특정 값)으로 HPLC 장치 (Spherisorb 열 연결되어 있음) 조정 및 튜브 매 1 분 변경 분획 수집기를 놓으십시오.
- HPLC 장치에 샘플을로드하고 동시에 분획 수집기를 시작합니다.
- 각 샘플에서 실행하고 표준 올리 고당 혼합물의 실행에서 1 ML 48 분수를 수집합니다.
- 각 분획에서 섬광 약병 500 μl를 전송하고, 물 miscible 섬광 유체 3 ML과 내용을 섞는다.
- 튜브를로드하고 신틸레이션 계수기에 참조하십시오.
- 노출당 비용 (CPM) 판독이 분수 번호 기능으로 꾸몄다 있습니다.
- 최대 노출당 비용 (CPM) 내의 값은 다음과 같이 특정 glycan 종의 대표 : 분수를 18-21도 M8, M9에 분수 36-39에 M5, M6 분수 22-26로, 분수를 27-31로 M7, 분수 32-35에 해당하는 분수 G2M9에 40-42로 G1M9과 분수 43-45.
- 각 피크 내에서 분수에 대한 노출당 비용 (CPM) 값의 합계는 특정 glycan 종의 절대 금액을 반영합니다. 각 glycan 종의 절대 금액이 포함된 mannose 잔류물의 숫자로 나누어 자세한 mannose 잔류물을 포함하는 종 더 레이블, 다음과 같이 계산되는 각 glycan 종의 "상대적 어금니 금액"을 획득했다는 사실에 대해 보상하기 위해서는 . 이 값은 다음 각 특정 glycan 종에 대해 "전체의 %를 '얻기 위해 얻은 모든 glycan 수종의 상대 어금니 금액의 합계로 나눈 것입니다.
| 체이스 (H) | 0 | 4 |
| 엔도 H (CPM)과 함께 출시 | 90,000 | 16,800 |
| N - glycosidase F (CPM)와 B 출시 | 20,400 | 3900 |
| retentate (CPM) C에서 Glycoproteins | 371700 | 127695 |
| retentate (CPM) D에 Dolichol - oligosaccharides | 4350 | 540 |
| retentate에 Dolichol - oligosaccharides (%) E | 1.4 ± 0.7 | 0.2 ± 0.2 |
표 1. deglycosidases과 당단백질 샘플에 dolichol - oligosaccharides의 존재의 N - 연결 설탕 체인 릴리스의 분석.
우리는 NIH 3T3 세포에서 lysate로 펄스 체이스 절차를 적용. Microcon 여과 후, 표시된 N - 연결 oligosaccharides는 펄스 라벨 (높은 mannose 타입) 후 복잡한 유형 (잠돌군 Zz - 처리 glycans)에 해당하는 것입니다 추격전이 기간이 지나면 N - glycosidase F 조로 추가 치료와 엔도 H 주로 출시되었습니다 엔도 H 저항 oligosaccharides. 이것은 정량 분석 dolichol - oligosaccharides가 초기 retentate에서 라벨의 사소한 분율 차지하는 사실을 확인했습니다.
참고 :
- NIH 3T3 세포는 펄스는 [2-3 H]와 라벨이 붙지만 mannose하고 완전한 매체로 추격. Microcon YM30을 통해 세포 용해 및 여과 후, 높은 mannose oligosaccharides N - 연결은 엔도 H.와 부화하여 retentates에서 출시되었습니다
- (A)에서 Microcon의 retentates에서 엔도 H - 모성 자료는 다음 N - glycosidase F 조와 incubated 및 신틸레이션 계수기로 측정 oligosaccharides를 발표했다.
- 메탄올 : 전구체 glycolipids를 제거하는 물 10시 10분 3초하고, 1N NaOH의 solubilized 및 섬광 카운터에서 계산 unextracted 소재 Microcon의 retentates는 (a) 엔도 H 처리하기 전에, 클로로포름과 4 번 추출되었다 같이 취득.
- Dolichol - oligosaccharides은 (C)로 1에서 설명하고 섬광 카운터에서 계산에서 추출에서 정화했다.
- retentate 총 노출당 비용 (CPM)의 dolichol - oligosaccharides (D) 비율 3 실험의 평균 (C + D).
대표 결과
그림 1. 치료 세포에서 proteasomal 억제에 총 NIH 3T3 glycoproteins의 펄스 체이스 분석 1 시간 후와 펄스 라벨. [2-3 H] 우리는 glucosylated과 예상 프로파일을 획득엽 성의 전구 물질은 (Glc 두 남자 9 GlcNAc 2 (G2M9)와 G1M9) 남아 있지만, M9에있는 라벨 및 M8 종의 대부분은, 후자는 모든 포도당의 트리밍 한 mannose 잔류물 (그림 1)의 결과를 모셨습니다. 아무도 무료로 mannose 또는 기타 작은 엽 성의 전구 물질은 정화의 철저에 증명, 발견되지 않았습니다. 다소 긴 8h 체이스 다음이 M7 - 6와 M5의 작은 금액 트리밍 더 광범위한했지만, 주요 수종은 M9와 M8 (그림 1 B)로 계속했다. 추적이 proteasomal 억제제 (30 μm의 MG - 132)의 존재로 이루어졌다면, 다음과 같은 손질 종의 사소한 축적 (그림 1 C)은 오직가 발생했습니다.
그림 2. ERAD 기판의 설탕 체인의 정량 분석 총 glycoproteins에 비해. (A) 그림 1에있는 것과 유사한 실험에서, 각 올리 고당 종 상대 어금니 금액은 mannose 콘텐츠를 기반으로 계산했다. 우리는 각 glycan 종족에 대한 얻은 CPM 값을 변환, 모든 종류의 현재의 상대 어금니 금액의 총 합계를 기준으로 각 종족의 %가 후 두 실험의 평균 추적 시간의 함수로 꾸몄다되었습니다. (B)과 유사 을 (A) ERAD 기판 ASGPR H2a에서 공개 glycans를 제외하고 분석 나서 앞에서 4h 추적에 대한 proteasomal 억제제 MG - 132의 존재 또는 부재에 4h까지에 대한 펄스 상표와 체이스가. (C) 값 에서 MG - 132의 (A)와 (B) ASGPR H2a 및 당단백질 수영장에 대한 비교됩니다. 응급실에서 프로세스를 트리밍 N - 연결 설탕 체인 (D) 제도. 이들에 대한 M9 - 8에 비해 ERAD를 타겟으로하는 단백질 (R) 그 잠돌군 Zz와 근교로 종료합니다. 연결된 M6 - 5로 이어질 설탕 트리밍 처리 결과는 ERAD 프로세스 mannose 남은 5-6 mannose 잔류물과 종족을 항복하기 위해 N - glycans의 트리밍과 관련된 것으로 나타났습니다.
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Discussion
HPLC 분리 살 세포의 glycans의 펄스 체이스 분석 당단백질의 생활 전반에 걸쳐 올리 고당 구조 변경의 역학을 연구하는 방법을 제공합니다. 이러한 변경은 ER의 접이식, 품질 관리 및 인신 매매 시스템 2-5에 대한 신호를 생산에 관여하는 성장 증거가있다. 방법뿐만 아니라 관심의 특정 당단백질뿐만 아니라 우리가 대조 특정 ERAD 기판의 운명과 세포 당단백질 수영장의 비교이 문서에 설명된 총 glycoproteins, 구조의 역학을 분석하는 데 적용할 수 있습니다 . 정화 기술은 간단하지만, 그럼에도 불구하고 구체적인 것입니다. 이러한 O - 연결된 설탕 체인 및 GPI - 정박 단백질로 인간 - 엄격한 deglycosidases와 분자 여과를 사용하여 그것은 [3 H 2]로 표시된 다른 macromolecules 남겨두고, glycoproteins에서 출시만을 N - 연결 glycans를 얻을 것을 보장합니다. dolichol 전구체에서 발표 Oligosaccharides은 무시할 오염 물질 (표 1)입니다.
방법은 자료를 시작하는 아주 소량을 사용하여 감지 높은 감도를 제공합니다. 매우 낮은 수율을 기대하면 감도가 더욱 SpeedVac을 사용하여 HPLC의 분수의 볼륨을 줄여 증가 수 있습니다. 따라서 섬광 유체의 용해도의 제한을 극복할 수 있으며, 분수의 전체 내용은 섬광 카운터에서 모니터링할 수 있습니다.
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Acknowledgments
우리는 기술 지원 Zehavit Frenkel와 산드라 Tolchinsky 감사드립니다. 이 작품은 관련 연구는 이스라엘 과학 재단 (1229년에서 1207년까지)과 독일 - 이스라엘 프로젝트 협력 (DIP - DFG)에서 기금에 의해 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 600E Multisolvent delivery System controller | Waters | WAT062710 | |
| Acetonitrile LiChrosolv (gradient grade for liquid chromatography) | Merck & Co., Inc. | 1.0003 | |
| Microcon Amicon Ultra 0.5 ml 30K or Centricon ultracel YM-30 | EMD Millipore | UFC503024 or 4208 | |
| Concentrator 5301, incl. 48 x 1.5 / 2.0 ml fixed-angle rotor | Eppendorf | 5301 000.016 | |
| Dialyzed F–tal Calf Serum | Biological Industries | 04-011-1A | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | GIBCO, by Life Technologies | 41965039 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - glucose free | Sigma-Aldrich | D5030 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D1408 | |
| EDTA disodium salt(Titriplex Iii) | Merck & Co., Inc. | 1084180250 | |
| Endo Hf Kit (1,000,000 units/ml) | New England Biolabs | p0703S | |
| F–tal Calf Serum (FCS) | Biological Industries | 04-001-1A | |
| Frac-100 fraction collector | Amersham | 18-1000-77 | |
| LS 6500 Liquid Scintillation Counting systems | Beckman Coulter Inc. | 510720 | |
| Mannose, D-[2-3H(N)]- (Specific Activity: 15-30Ci/mmol) | PerkinElmer, Inc. | NET570A | |
| N-carbobenzoxyl-leucinyl-leucinyl-leucinal (MG-132) | Calbiochem | 474790 | |
| N-glycosidase F (1000 units/ml) | Roche Group | 11365177 | |
| N-octylglucoside | Sigma-Aldrich | O3757 | |
| NIH 3T3 cells | American Type Culture Collection | CRL-1658 | |
| Opti-Flour | PerkinElmer, Inc. | 6013199 | |
| Phosphoric acid solution ( 49-51%, for HPLC) | Fluka | 79607 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | P2714 | |
| Protein A-Sepharose beads | Repligen | IPA300 | |
| Rabbit polyclonal anti-H2 carboxy-terminal 6 | |||
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Bio-Rad | 161-0301 | |
| Sodium phosphate | Sigma-Aldrich | 342483 | |
| Sodium pyruvate solution (100mM) | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| Spherisorb NH2 Column, 5 μm, 4.6 x 250 mm | Waters | PSS831115 | |
| Triton X-100 | VWR | 306324N | |
| Vibra-Cell ultrasonic processors VCX 750 | Sonics and Materials, Inc. | 690-003 | |
| Buffer A: 1% Triton X-100, 0.5% w/v sodium deoxycholate, Protease inhibitor cocktail 2% v/v in PBS | |||
| Buffer B: 0.5% w/v SDS, Protease inhibitor cocktail 2% v/v in PBS | |||
| Buffer C: N-glycosidase F reaction buffer: 200mM Na3PO4, pH 8.0, 4mM EDTA, 1.5% N-octylglucoside | |||
| NIH 3T3 stably expressing H2a 6 | |||
| Buffer D: 0.5% Triton X-100, 0.25% w/v sodium deoxycholate,0.5% w/v SDS, Protease inhibitor cocktail 2% v/v in PBS | |||
| Buffer E: 0.5% w/v SDS, 1% v/v 2-Mercapt–thanol, Protease inhibitor cocktail 2% v/v in PBS | |||
| 2-mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M3148 |
References
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- Avezov, E., Frenkel, Z., Ehrlich, M., Herscovics, A., Lederkremer, G. Z. Endoplasmic reticulum (ER) mannosidase I is compartmentalized and required for N-glycan trimming to Man5-6GlcNAc2 in glycoprotein ER-associated degradation. Mol Biol Cell. 19 (1), 216-225 (2008).
- Frenkel, Z., Gregory, W., Kornfeld, S., Lederkremer, G. Z. Endoplasmic reticulum-associated degradation of mammalian glycoproteins involves sugar chain trimming to Man6-5GlcNAc2. J Biol Chem. 278 (36), 34119-34124 (2003).
- Hosokawa, N. Enhancement of endoplasmic reticulum (ER) degradation of misfolded Null Hong Kong alpha1-antitrypsin by human ER mannosidase I. J Biol Chem. 278 (28), 26287-26294 (2003).
- Jakob, C. A., Burda, P., Roth, J., Aebi, M. Degradation of misfolded endoplasmic reticulum glycoproteins in Saccharomyces cerevisiae is determined by a specific oligosaccharide structure. J Cell Biol. 142 (5), 1223-1233 (1998).
- Tolchinsky, S., Yuk, M. H., Ayalon, M., Lodish, H. F., Lederkremer, G. Z. Membrane-bound versus secreted forms of human asialoglycoprotein receptor subunits. Role of a juxtamembrane pentapeptide. J Biol Chem. 271 (24), 14496-14503 (1996).
