Name: Pulso-chase Análise de Cadeias N-linked Açúcar de Glicoproteínas em células de mamíferos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-27T17:10:00.000+00:00
Duration: 10 min 17 s
Description: Aprenda análise pulse-chase de glicanos N-linked em glicoproteínas de células de mamíferos usando marcação metabólica e HPLC. Este método permite rastrear dinamicamente alterações nos açúcares durante a biossíntese.

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Agradecemos a Zehavit Frenkel e Sandra Tolchinsky para assistência técnica. Pesquisas relacionadas a este trabalho é suportado por concessões do Ciência Israel Foundation (1229-1207) eo alemão-israelense Projeto de Cooperação (DIP DFG).

O seguinte protocolo destina-se a análise de cadeias de açúcar de glicoproteínas total ou de uma glicoproteína específica de interesse. O procedimento é basicamente o mesmo para ambos os casos, com algumas alterações como indicado ao longo do protocolo. <ol><li> Para a rotulagem metabólica de N-glicanos ligados a pessoa precisa usar uma cultura confluentes de células de mamíferos cultivadas durante a noite em um prato de 90 mm para cada amostra (amostras podem representar diferentes momentos ou tratamentos). Este protocolo é otimizado para as células NIH 3T3. </li><li> Morrer de fome as células para a glicose através da incubação em 5 ml de recém-preparados médio pré-aquecido (37 ° C), glicose-free, fornecido com 10% FCS dialisadas e 4 mM piruvato de sódio por 5-15 minutos. </li><li> Substituir o meio de fome com 1 ml da pré-aquecido (37 ° C) sem glicose meio contendo 400 μCi de [2-3 H] marcado manose (menor concentração de 65 μCi / ml é utilizado para a rotulagem de glicoproteínas total), e incubar as células do tecido normal condições de cultura para uma hora. </li><li> Remova a mídia de rotulagem de cada amostra e, cuidadosamente, adicionar 2 ml de PBS a 4 ° C para as amostras correspondentes a pulso e coloque-os sobre gelo (estas amostras são referidos como pulsos), enquanto as amostras correspondentes ao assunto precisa ser lavado 3 vezes com 2 ml de pré-aquecido (37 ° C) meio de cultura normal, completa, e depois colocados em uma incubadora de CO 2 a 37 ° C com 5 ml de pré-aquecido médio regular para o período desejado perseguição. </li><li> Lave as amostras de pulso (previamente colocado no gelo) 3 vezes com 2 ml de PBS gelado. As células são então raspado o prato em 2 ml de PBS com uma espátula de células, e colocado em um tubo Eppendorf 2 ml. </li><li> Curto girar a células em 16000Xg (6-10 seg), desprezar o sobrenadante e congelar o pellet celular a -80 ° C. </li><li> Execute os passos 5 e 6 também para as amostras de perseguição no final do tempo de perseguição. </li><li> Remove as células do congelador e lisar-los através da adição de 300 l de tampão A, brevemente vórtex e incubar por 20 min no gelo, ou no caso de análise de glicoproteínas total, por 20 min de incubação no gelo com tampão B, seguidos por sonicação (4 vezes, 10 segundos, máxima amplitude), em seguida, ferver as amostras para 5min. </li><li> Centrifugar a lisados ​​em 16000Xg por 20 min a 4 ° C. Transfira o sobrenadante para um tubo Eppendorf novo e descartar o pellet. </li><li> Se a análise de glicoproteínas total, proceder à filtração molecular e deglycosylation (passo 17). Para imunoprecipitação da glicoproteína H2a demonstrado aqui, adicione 20l/sample de (Repligen) proteína A-agarose contas 01:01 de suspensão e 3 mL / amostra do nosso coelho anticorpo policlonal anti H2a para a glicoproteína desejado (no nosso exemplo de anticorpos anti-H2a ), para o sobrenadante do passo 9. </li><li> Incubar as amostras para 4-16 horas a 4 ° C, em constante mistura por rotação lenta. </li><li> Spin para baixo as contas em 16000Xg por 30 segundos, e remova cuidadosamente o vácuo sobrenadante usando. </li><li> Lave as contas, por adição de 500 mL de buffer D e vórtice. Rotação como no passo 12 e remover o sobrenadante. Repetir a lavagem três vezes. </li><li> Adicionar 10μl tampão de desnaturação (fornecido com o endo-H NEB kit) para o pellet talão e ferva as amostras por 5 min (quando as proteínas totais são analisados, a deglycosylation é realizado no filtro microcontrolador, passo 17). </li><li> Girar as esferas (16000Xg por 30 segundos), e transferir o sobrenadante para um tubo Eppendorf novo. Então 0.5μl da enzima endo H são adicionados a cada amostra, juntamente com 10 ml do tampão de reação (também fornecido com o kit H endo NEB) e as amostras são incubadas a 37 ° C por 3 horas. </li><li> Para separar os glicanos liberada a partir das proteínas, a amostra é diluída 5 vezes com água deionizada e colocado em cima de um filtro molecular (microcontrolador Ultracel YM30), com um corte de 30kDa, em seguida, centrifugado a 14000Xg por 3 min. Aplicar 50μl de água deionizada e repetir a centrifugação das amostras. Esta lavagem é repetida vezes mais 2, mantendo o escoamento. </li><li> Se você está analisando glicoproteínas total, aplicar o sobrenadante do lisados ​​(a partir do passo 9) para o filtro microcontrolador. Lavar o extrato com 100 l de tampão E, 3 vezes por centrifugação repetida em 14000Xg por 3 min. Adicionar 3 mL de tampão de reação 10X endo H e 1,5 mL da enzima endo H ao retentado microcontrolador, e incubar durante 3 horas a 37 ° C. Os glicanos liberados são eluídos com água deionizada por 3 centrifugações repetidas, como no passo 16. </li><li> Se desejar, retentados das etapas 16 e 17, contendo endo H-resistentes glicoproteínas são então incubadas com 200mU de N-glicosidase F em 15 mL de tampão C a 37 ° C por 16 h. Eluição com água deionizada é feito como na etapa 16. </li><li> Coloque o tubo que contém o endo H reação de fluxo (etapas 16 e 17) em um concentrador SpeedVac, E secar as amostras completamente (este pode ser feito até 45 ° C para acelerar esse processo). </li><li> Para preparar as amostras para a HPLC, ressuspender o pellets secos em 12 mL do solvente HPLC (acetonitrila: água, 60:40, ácido fosfórico 1%). </li><li> Ajustar o dispositivo de HPLC (conectado à coluna Spherisorb) para fluxo constante de solvente (1 ml / min) e pressão (um valor em particular entre 1000 e 2000 psi), e colocar um coletor de frações para mudar um tubo a cada 1 minuto. </li><li> Carregar as amostras no dispositivo HPLC e iniciar o coletor de fração ao mesmo tempo. </li><li> Coletar 48 frações de 1 ml de cada amostra e executar de uma corrida de uma mistura padrão de oligossacarídeos. </li><li> Transferência de 500 mL de cada fração para um frasco de cintilação, e misturar o conteúdo com 3 ml de água-miscível líquido de cintilação. </li><li> Carregar os frascos e lido em um contador de cintilação. </li><li> A leitura cpm é plotado como uma função do número fracionário. </li><li> Os valores cpm dentro de um pico de representar uma espécie específica glicano como segue: frações 18-21 correspondem a M5, M6 para frações 22-26, 27-31 frações de M7, frações 32-35 a M8, frações 36-39 a M9, frações 40-42 para 43-45 G1M9 e frações de G2M9. </li><li> A soma dos valores cpm para as frações dentro de cada pico reflete a quantidade absoluta de uma espécie glicano específico. , A fim de compensar o fato de que as espécies que contenham mais resíduos de manose adquirir mais etiqueta, a "quantidade relativa molar" de cada espécie glicano é calculado da seguinte forma: a quantidade absoluta de cada espécie glicano é dividido pelo número de resíduos de manose que contém . Este valor é então dividido pela soma dos montantes relativos molar de todas as espécies glicano obtidos para obter o "por cento do total" para cada espécie glicano específico. </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td style="text-align:center;"> Chase (h) </td><td style="text-align:center;"> 0 </td><td style="text-align:center;"> 4 </td></tr><tr><td> Lançado com endo H (cpm) a </td><td> 90000 </td><td> 16800 </td></tr><tr><td> Lançado com N-glicosidase F (cpm) b </td><td> 20400 </td><td> 3900 </td></tr><tr><td> Glicoproteínas no retentado (cpm) c </td><td> 371700 </td><td> 127695 </td></tr><tr><td> Dolicol-oligossacarídeos no retentado (cpm) d </td><td> 4350 </td><td> 540 </td></tr><tr><td> Dolicol-oligossacarídeos no retentado (%) e </td><td> 1,4 ± 0,7 </td><td> 0,2 ± 0,2 </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Análise da liberação de cadeias N-linked açúcar com deglycosidases e da presença de Dolicol-oligossacarídeos em amostras de glicoproteína. Foi aplicado o procedimento de pulso-caça a um lisado de células NIH 3T3. Após filtração microcontrolador, rotulado N-linked oligossacarídeos foram liberados principalmente com endo H após a rotulagem de pulso (tipo manose alta) e com tratamento adicional com N-glicosidase F após um período de perseguição, o que corresponderia a tipo complexo (Golgi-processados ​​glicanos), oligossacarídeos endo H resistente. Esta análise quantitativa determinou que Dolicol-oligossacarídeos, foi responsável por uma fração insignificante do rótulo no retentado inicial. Notas: <ol class="lalpha"><li> Células NIH 3T3 foram pulso marcado com [2-3 H] manose e perseguido com meio completo. Após a lise celular e filtração através de microcontrolador YM30, alta manose N-linked oligossacarídeos foram liberados de retentados de incubação com Endo H. </li><li> Endo material de H-resistentes em retentados microcontrolador a partir de (a) foi então incubada com N-glicosidase F e liberado oligossacarídeos medida em um contador de cintilação. </li><li> Retentados microcontrolador obtida como em (a) antes do tratamento endo H, foram extraídos quatro vezes com clorofórmio: metanol: água para remover 10:10:03 glycolipids precursor, eo material não extraído solubilizado em NaOH 1N e contados em um contador de cintilação. </li><li> Dolicol-oligossacarídeos foram purificados de extratos a partir de (c) como descrito em 1 e contados em um contador de cintilação. </li><li> Média de 3 experimentos para por cento do Dolicol-oligossacarídeos (d) de cpm total de retentado (c + d). </li></ol> Resultados representante <img src="/files/ftp_upload/1899/1899fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Pulso-chase análise de glicoproteínas total de NIH 3T3 em células não tratadas e sobre a inibição proteosomal Após 1h de pulso com rotulagem. [2-3 H] obtivemos um perfil esperado com alguma glucosylatedprecursores restante (Glc Man 2 9 GlcNAc 2 (G2M9) e G1M9), mas a maioria do rótulo presente em M9 e M8 espécies, sendo este último o resultado do corte de toda a glicose e um resíduo de manose (Figura 1 A). No free manose ou outros pequenos precursores foram detectados, atestando a meticulosidade da purificação. Na sequência de um pouco longo 8h perseguição havia mais extenso corte para M7-6 e uma pequena quantidade de M5, mas as principais espécies continuaram a ser M9 e M8 (Figura 1 B). Se a perseguição foi feito na presença de um inibidor proteosomal (30 mM MG-132), havia apenas um acúmulo menor dessas espécies mesmo aparadas (Figura 1 C). <img src="/files/ftp_upload/1899/1899fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Análise quantitativa de cadeias de açúcar de um substrato ERAD comparação com glicoproteínas total. (A) Em um experimento semelhante ao da Figura 1, relativa quantidade molar de cada espécie de oligossacarídeos foram calculados com base no conteúdo de manose. Convertemos os valores obtidos cpm para cada espécie glicano, a porcentagem de cada espécie em relação à soma total dos valores relativos molar de todos os presentes espécies foi então plotado como uma função do tempo de perseguição por uma média de dois experimentos. (B) Similar para (A), exceto que glicanos liberado do substrato ERAD ASGPR H2a foram analisados ​​após a rotulagem de pulso e de perseguição por até 4h, na presença ou ausência do inibidor proteosomal MG-132. (C) Os valores para 4h de perseguição na presença da MG-132 a partir de (A) e (B) são comparados para ASGPR H2a ea piscina glicoproteína. (D) Regime de N-linked cadeia de açúcar corte processos na ER. Processos de corte de açúcar que levam à M6-5 ligado às proteínas (R) que são direcionados para ERAD comparação com M9-8 sobre aqueles que sair para o Golgi e além. Os resultados indicam que o processo ERAD é associado com a manose corte de N-glicanos para produzir espécies com 5-6 resíduos de manose restantes.

<ol><li>Parodi, A. J., Behrens, N. H., Leloir, L. F., Carminatti, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+polyprenol-bound+saccharides+as+intermediates+in+glycoprotein+synthesis+in+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The role of polyprenol-bound saccharides as intermediates in glycoprotein synthesis in liver.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 69 (11), 3268-3272 (1972).</li>
<li>Avezov, E., Frenkel, Z., Ehrlich, M., Herscovics, A., Lederkremer, G. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoplasmic+reticulum+%28ER%29+mannosidase+I+is+compartmentalized+and+required+for+N-glycan+trimming+to+Man5-6GlcNAc2+in+glycoprotein+ER-associated+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Endoplasmic reticulum (ER) mannosidase I is compartmentalized and required for N-glycan trimming to Man5-6GlcNAc2 in glycoprotein ER-associated degradation.</a> Mol Biol Cell. 19 (1), 216-225 (2008).</li>
<li>Frenkel, Z., Gregory, W., Kornfeld, S., Lederkremer, G. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoplasmic+reticulum-associated+degradation+of+mammalian+glycoproteins+involves+sugar+chain+trimming+to+Man6-5GlcNAc2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Endoplasmic reticulum-associated degradation of mammalian glycoproteins involves sugar chain trimming to Man6-5GlcNAc2.</a> J Biol Chem. 278 (36), 34119-34124 (2003).</li>
<li>Hosokawa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+endoplasmic+reticulum+%28ER%29+degradation+of+misfolded+Null+Hong+Kong+alpha1-antitrypsin+by+human+ER+mannosidase+I%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Enhancement of endoplasmic reticulum (ER) degradation of misfolded Null Hong Kong alpha1-antitrypsin by human ER mannosidase I.</a> J Biol Chem. 278 (28), 26287-26294 (2003).</li>
<li>Jakob, C. A., Burda, P., Roth, J., Aebi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Degradation+of+misfolded+endoplasmic+reticulum+glycoproteins+in+Saccharomyces+cerevisiae+is+determined+by+a+specific+oligosaccharide+structure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Degradation of misfolded endoplasmic reticulum glycoproteins in Saccharomyces cerevisiae is determined by a specific oligosaccharide structure.</a> J Cell Biol. 142 (5), 1223-1233 (1998).</li>
<li>Tolchinsky, S., Yuk, M. H., Ayalon, M., Lodish, H. F., Lederkremer, G. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-bound+versus+secreted+forms+of+human+asialoglycoprotein+receptor+subunits.+Role+of+a+juxtamembrane+pentapeptide%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Membrane-bound versus secreted forms of human asialoglycoprotein receptor subunits. Role of a juxtamembrane pentapeptide.</a> J Biol Chem. 271 (24), 14496-14503 (1996).</li>
</ol>

A análise do pulso-chase dos glicanos em células vivas, com separação por HPLC fornece um método para estudar a dinâmica do oligossacarídeo alterações estruturais ao longo da vida de uma glicoproteína. Há evidências crescentes de que tais alterações estão envolvidos na produção dos sinais de ER dobrar, controle de qualidade e 2-5 sistemas tráfico. O método pode ser aplicado não só para uma glicoproteína específica de interesse, mas também para analisar a dinâmica da estrutura de glicoproteínas total, como ilu...

<table><tbody><tr><td>Controlador do Sistema Multissolvente 600E</td><td>Águas</td><td>WAT062710</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrila LiChrosolv (grau gradiente para cromatografia líquida)</td><td>Merck &amp;& Cia., Inc.</td><td>1.0003</td><td></td></tr><tr><td>Microcon Amicon Ultra 0,5 ml 30K ou Centricon ultracel YM-30</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC503024 ou 4208</td><td></td></tr><tr><td>Concentrador 5301, incluindo rotor de ângulo fixo para 48 x 1,5 / 2,0 ml</td><td>Eppendorf</td><td>5301 000.016</td><td></td></tr><tr><td>F dialisado&amp;#8211;Soro de bezerro tal</td><td>Biological Industries</td><td>04-011-1A</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Eagle Modificado&amp;rsquo;s Médio</td><td>GIBCO, da Life Technologies</td><td>41965039</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Meio de Eagle Modificado&amp;rsquo;s Médio - sem glicose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5030</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Solução Salina Tamponada com Fosfato (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1408</td><td></td></tr><tr><td>sal dissódico de EDTA (Titriplex III)</td><td>Merck &amp;& Co., Inc.</td><td>1084180250</td><td></td></tr><tr><td>Endo Hf Kit (1.000.000 unidades/ml)</td><td>New England Biolabs</td><td>p0703S</td><td></td></tr><tr><td>F&amp;#8211;Soro bovino fetal (FBS)</td><td>Biological Industries</td><td>04-001-1A</td><td></td></tr><tr><td>coletor de frações Frac-100</td><td>Amersham</td><td>18-1000-77</td><td></td></tr><tr><td>Sistemas de contagem por cintilação líquida LS 6500</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>510720</td><td></td></tr><tr><td>Manose, D-[2-&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt;H(N)]- (Atividade específica: 15-30 Ci/mmol)</td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>NET570A</td><td></td></tr><tr><td>N-carbobenzoil-leucil-leucil-leucinal (MG-132)</td><td>Calbiochem</td><td>474790</td><td></td></tr><tr><td>N-glicosidase F (1000 unidades/ml)</td><td>Grupo Roche</td><td>11365177</td><td></td></tr><tr><td>N-octilglicosídeo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O3757</td><td></td></tr><tr><td>Células NIH 3T3</td><td>Coleção Americana de Culturas de Tipos</td><td>CRL-1658</td><td></td></tr><tr><td>Opti-Flour</td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>6013199</td><td></td></tr><tr><td>Solução de ácido fosfórico (49-51%, para HPLC)</td><td>Fluka</td><td>79607</td><td></td></tr><tr><td>Coquetel de Inibidores de Protease</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2714</td><td></td></tr><tr><td>Bolhas de Sepharose com proteína A</td><td>Repligen</td><td>IPA300</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo policlonal de coelho anti-H2 terminal carboxi &lt;sup&gt;6&lt;/sup&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Deoxicolato de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30970</td><td></td></tr><tr><td>Dodecilsulfato de sódio</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0301</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>342483</td><td></td></tr><tr><td>Solução de piruvato de sódio (100 mM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>Coluna Spherisorb NH2, 5 &amp;mu;m, 4,6 x 250 mm</td><td>Águas</td><td>PSS831115</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>VWR</td><td>306324N</td><td></td></tr><tr><td>Processadores ultrassônicos Vibra-Cell VCX 750</td><td>Sonics and Materials, Inc.</td><td>690-003</td><td></td></tr><tr><td>&lt;forte&gt;Tampão A:&lt;/strong&gt; 1% Triton X-100, 0,5% p/v deoxicolato de sódio, coquetel de inibidores de protease 2% v/v em PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;forte&gt;Tampão B:&lt;/strong&gt; 0,5% p/v SDS, coquetel de inibidores de protease 2% v/v em PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;forte&gt;Tampão C:&lt;/strong&gt; Tampão da reação de N-glicosidase F: 200 mM Na&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, pH 8,0, 4 mM EDTA, 1,5% N-octilglicosídeo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NIH 3T3 expressando estavelmente H2a &lt;sup&gt;6&lt;/sup&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;forte&gt;Tampão D:&lt;/strong&gt; 0,5% Triton X-100, 0,25% p/v desoxicolato de sódio, 0,5% p/v SDS, coquetel de inibidores de protease 2% v/v em PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;forte&gt;Tampão E:&lt;/strong&gt; 0,5% p/v SDS, 1% v/v 2-Mercaptoetanol&amp;#8211;etanol, coquetel de inibidores de protease 2% v/v em PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoetanol&amp;#8211;etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr></tbody></table>

pulso-chase análise de cadeias n-linked açúcar de glicoproteínas em células de mamíferos

Pulse-chase Analysis of N-linked Sugar Chains from Glycoproteins in Mammalian Cells

Fixação do Glc<sub&gt; 3</sub&gt; Homem<sub&gt; 9</sub&gt; GlcNAc<sub&gt; 2</sub&gt; Precursor oligossacarídeo de polipeptídeos nascentes na ER é uma modificação comum para proteínas secretoras. Embora esta modificação foi implicado em vários processos biológicos, os aspectos adicionais de sua função estão surgindo, com a evidência recente de seu papel na produção de sinais para o controle de qualidade e glicoproteína tráfico. Assim, os fenômenos relacionados com a N-glicanos ligados e seu processamento estão sendo intensamente investigadas. Métodos que têm sido recentemente desenvolvidos para a análise proteômica têm melhorado bastante a caracterização da glicoproteína N-glicanos ligados. No entanto, eles não fornecem insights sobre a dinâmica da cadeia de processamento de açúcar envolvidos. Para isso, rotulagem e protocolos de pulso-chase análise são usados ​​que normalmente são complexos e dão rendimentos muito baixos. Descrevemos aqui um método simples para o isolamento e análise de metabolicamente marcados N-linked oligossacarídeos. O protocolo baseia-se na marcação das células com [2 -<sup&gt; 3</sup&gt; H] lise, desnaturação manose e liberação enzimática do oligossacarídeos a partir de qualquer uma proteína específica immunoprecipitated de interesse ou da piscina glicoproteína geral por meio de tratamentos seqüenciais com endo H e N-glicosidase F, seguido de filtração molecular (Amicon). Neste método, os oligossacarídeos isolados servir como insumo para HPLC análise, que permite a discriminação entre as várias estruturas glicano acordo com o número de unidades de monossacarídeo composto por eles, com uma resolução de um monossacarídeo único. Usando este método conseguimos estudar alta manose N-linked perfis de oligossacarídeos de glicoproteínas total de células após o pulso-chase em condições normais e sob inibição do proteassoma. Esses perfis foram comparados com aqueles obtidos a partir de uma ER associada à degradação do substrato immunoprecipitated (ERAD). Nossos resultados sugerem que a maioria dos NIH 3T3 glicoproteínas celulares são relativamente estáveis ​​e que a maioria de seus oligossacarídeos são aparados para Homem<sub&gt; 08/09</sub&gt; GlcNAc<sub&gt; 2</sub&gt;. Em contraste, substratos ERAD instáveis ​​são aparados para Homem<sub&gt; 05/06</sub&gt; GlcNAc<sub&gt; 2</sub&gt; E glicoproteínas tendo estas espécies se acumulam sobre a inibição da degradação proteosomal.

Nós descrevemos um método para análise da alteração da N-glicanos ligados através do início da vida de glicoproteínas após a sua biossíntese em células de mamíferos. Isto é conseguido através de pulso-chase análise de glicanos metabolicamente marcados, a liberação enzimática das glicoproteínas e análise por HPLC.

Pulso-chase Análise de Cadeias N-linked Açúcar de Glicoproteínas em células de mamíferos

A anexação do oligossacarídeo precursor Glc3Man9GlcNAc2 a polipeptídeos nascentes no RE é uma modificação comum para proteínas secretoras. Embora...

A análise das cadeias de açúcar não ligadas em glicoproteínas começa com a marcação dos glicanos e das células com manose tritiada. O prato de pulso é resfriado em gelo, enquanto o prato de "chase" é incubado sem marcação por um período desejado de "chase". Em seguida, as amostras são lisadas e uma glicoproteína de interesse é imunopurificada, desnaturada, e seus glicanos são liberados enzimaticamente.Os oligossacarídeos são posteriormente purificados por filtração molecular, que os separa das proteínas e de outras impurezas maiores que 30 quilodaltons. Os glicanos são então separados por CLAE. A quantidade de cada forma de glicano é determinada pela medição da intensidade do sinal radioativo em cada fração eluída.Olá, sou Edward Azo do laboratório de Hi Geraldo Letter Kremer, do Departamento de Pesquisa Celular e Imunologia da Universidade de Tel Aviv. Também sou do Laboratório Gerardo Letter Kremer. E hoje vamos mostrar um procedimento para o isolamento e análise de oligossacarídeos ligados e marcados metabolicamente.Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar a dinâmica do processamento de cadeias de açúcar em pools totais de glicoproteínas celulares e em glic

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Determinar a posição do ciclo celular de uma população de células, ou a compreensão de como os sinais de afetar a proliferação, pode ser facilmente medido por citometria de fluxo usando esse protocolo. Relatamos uma abordagem simples experimental da coloração células e quantificar a sua posição no ciclo celular.

Análise da posição do ciclo celular em células de mamíferos

As proteínas de superfície são biologicamente importantes e amplamente glicosilada. Apresentamos aqui uma abordagem de captura de glycopeptide para solubilizar, enriquecer e deglycosylate estas proteínas para análise proteômica baseada LC-MS fáceis.

Captura de glicopeptídeos de Superfície Celular Proteômica

A fim de explorar de forma abrangente a diversidade de glicanos ligados a O, um novo procedimento para eliminação de β redutora em gel, combinado com permetilação e um método de partição rápida de fase, é aplicado à análise de glicanos ligados a O diretamente liberados de glicoproteínas resolvidas por SDS-PAGE e passíveis de análise glicômica subsequente por espectrometria de massa.

Melhorou em-gel redutivas β-eliminação para Comprehensive O-ligados e sulfo-glycomics por Espectrometria de Massa

Um protocolo de alto rendimento foi desenvolvido para purificação combinada de proteômica e glicômica e quantificação de LC-MS/MS no plasma. A análise de desamidação de motivos de glicosilação ligados a N foi específica para locais desglicosilados. A quantificação precisa de N-glicanos foi alcançada acoplando a separação de N-glicanos auxiliada por filtro à normalização da individualidade ao marcar com a estratégia de marcadores de hidrazida de glicano.

A Quantitative Glycomics e Proteomics Combinada estratégia de purificação

Este artigo apresenta uma forma aprimorada de uma nova técnica de glicômica de baixo para cima projetada para analisar o perfil de composição agrupado de glicanos em biofluidos não fracionados por meio da decomposição química de glicanos em seus monossacarídeos específicos de ligação constituinte para detecção por GC-MS. As aplicações potenciais incluem a detecção precoce de câncer e outros distúrbios afetivos glicanos.

Glicanos Análise Node: uma abordagem de baixo para cima para Glycomics

Descreve-se um método modificado para o isolamento de fracção de membrana a partir de células humanas e de preparação da amostra para a detecção de -glycosylation SCAP N e proteína total, utilizando Western blot. Nós introduzimos ainda um método de rotulagem GFP para monitorar o tráfico SCAP usando microscopia confocal. Este protocolo pode ser utilizado em laboratórios de biologia regulares.

Análise do SCAP<em&gt; N</em&gt; -glycosylation E Tráfico de Células Humanas

Aqui descrevemos um protocolo para um método de pulso-perseguição geral que permite a análise cinética de dobramento, transporte e degradação de proteínas a serem seguidos em células vivas.

Análise de proteínas, transporte e degradação em células vivas por pulso radioativo Chase

A imunoglobulina G (IgG) N-glicano é caracterizada por meio de cromatografia de interação hidrofílica UPLC. Além disso, a estrutura do IgG N-glican é claramente separada. Apresentado aqui é uma introdução a este método experimental para que ele possa ser amplamente utilizado em ambientes de pesquisa.

Análise de imunoglobulina G N-Glycan por cromatografia líquida de ultra-desempenho

Modificações pós-translacionais (PTMs) alteram estruturas e funções proteicas. Métodos para o enriquecimento simultâneo de vários tipos de PTM podem maximizar a cobertura nas análises. Apresentamos um protocolo utilizando cromatografia de afinidade metálica ti(IV) automobilizada duplamente, seguida de espectrometria de massa para o enriquecimento simultâneo e análise da proteína N-glicosilação e fosforilação em tecidos pancreáticos.

Uma estratégia de enriquecimento de ponta de spin para análise simultânea de N-glicopeptídeos e Fosfopeptídeos de Tecidos Pancreáticos Humanos

Aqui, propomos um protocolo simples que combina engenharia de oligossacarídeos metabólicos, química de clique e microscopia de expansão que permite a bioimagem de N-glicoproteínas sialiladas intracelulares com resolução aprimorada usando equipamentos de microscopia de rotina.

Visualização da Sialilação Intracelular com Química Click e Microscopia de Expansão

Aprenda análise pulse-chase de glicanos N-linked em glicoproteínas de células de mamíferos usando marcação metabólica e HPLC. Este método permite rastrear dinamicamente alterações nos açúcares durante a biossíntese.

Pulso-chase Análise de Cadeias N-linked Açúcar de Glicoproteínas em células de mamíferos

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