Pulso-chase Análise de Cadeias N-linked Açúcar de Glicoproteínas em células de mamíferos

A análise das cadeias de açúcar não ligadas em glicoproteínas começa com a marcação dos glicanos e das células com manose tritiada. O prato de pulso é resfriado em gelo, enquanto o prato de "chase" é incubado sem marcação por um período desejado de "chase". Em seguida, as amostras são lisadas e uma glicoproteína de interesse é imunopurificada, desnaturada, e seus glicanos são liberados enzimaticamente.

Os oligossacarídeos são posteriormente purificados por filtração molecular, que os separa das proteínas e de outras impurezas maiores que 30 quilodaltons. Os glicanos são então separados por CLAE. A quantidade de cada forma de glicano é determinada pela medição da intensidade do sinal radioativo em cada fração eluída.

Olá, sou Edward Azo do laboratório de Hi Geraldo Letter Kremer, do Departamento de Pesquisa Celular e Imunologia da Universidade de Tel Aviv. Também sou do Laboratório Gerardo Letter Kremer. E hoje vamos mostrar um procedimento para o isolamento e análise de oligossacarídeos ligados e marcados metabolicamente.

Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar a dinâmica do processamento de cadeias de açúcar em pools totais de glicoproteínas celulares e em glicoproteínas individuais. Ok, agora vamos começar. Para iniciar este procedimento, utilize células NIH 3T3 cultivadas durante a noite em uma placa de 90 milímetros.

Para cada amostra, o cultivo está subconfluente para privar as células de glicose; prepare meio fresco duas vezes sem glicose, suplementado com 20% de FCS dialisado e oito milimolares de piruvato de sódio. Dilua um volume da quantidade desejada do meio 2X com um volume de água desionizada. Pré-aqueça o meio e, em seguida, incube cada amostra celular em cinco mililitros do meio fresco pré-aquecido por cinco a 15 minutos. Se o período de "chase" for superior a 12 horas, as células devem ser manipuladas em condições estéreis.

Após o período de incubação, marque as placas correspondentes às amostras de pulso e chase. Para marcar os glicanos n para análise de glicoproteínas por imunoprecipitação, substitua o meio de privação por um mililitro de meio sem glicose, pré-aquecido, suplementado com 400 microcuries por mililitro de dois manoses marcados com trítio. Utilize 65 microcuries por mililitro para marcação e análise de glicoproteínas totais.

Após substituir o meio de inanição, incubar as células em condições normais de cultura de tecidos por uma hora. Ao final da incubação de uma hora, remover o meio de marcação de todas as amostras. Adicionar cuidadosamente dois mililitros de PBS a quatro graus Celsius às amostras correspondentes ao pulso e colocá-las no gelo. Essas amostras são denominadas pulsos.

Utilize dois mililitros de meio de cultura completo normal pré-aquecido. Enxágue as amostras de chased três vezes. Em seguida, adicione cinco mililitros do meio regular pré-aquecido às células.

Coloque as amostras de "chase" em um incubador com dióxido de carbono a 37 graus Celsius pelos períodos desejados de "chase". Durante a incubação das amostras de "chase", lave as amostras de "pulse", que foram mantidas em gelo, três vezes com dois mililitros de PBS frio a 4 °C. Em seguida, use um espátula celular para desprender as células da placa.

Em dois mililitros de PBS, coloque as células liberadas em um tubo EOR de dois mililitros. Centrifugue as células a 16.000 ×g por seis a 10 segundos para remover o sobrenadante e congele o pellet celular a menos 80 graus Celsius. Quando a incubação das amostras de chasing terminar, enxágue-as.

Centrifugue e armazene conforme acabou de ser demonstrado para as amostras de pulso. Quando estiver pronto para prosseguir com a lise celular, retire as células do congelador. Para a análise de IP, lise as células adicionando 300 microlitros de tampão.

Vortex brevemente e incubar por 20 minutos no gelo. Para análise das amostras de glicoproteínas totais em 300 microlitros do tampão B, incubar as células por 20 minutos no gelo, seguido de sonicação quatro vezes, 10 segundos cada vez, com amplitude máxima. Em seguida, ferver as amostras por cinco minutos.

Por fim, centrifugue todas as lisados a 16.000 Gs durante 20 minutos a quatro graus Celsius. Transfira o sobrenadante para um novo tubo EOR e descarte o precipitado. Prossiga para IP para examinar uma proteína de interesse para imunoprecipitação da glicoproteína H duas A demonstrada aqui.

Adicione 20 microlitros por amostra de proteína, A agro speeds e três microlitros por amostra do anticorpo policlonal de coelho anti H two A do laboratório ao sobrenadante das células lisadas. Incube as amostras por quatro a 16 horas a quatro graus Celsius, misturando constantemente por rotação lenta. Ao final da incubação, centrifugue os grânulos e remova cuidadosamente o sobrenadante utilizando vácuo, lave os grânulos quatro vezes adicionando 500 microlitros de buffer tea.

Centrifugue quatro vezes, descartando o sobrenatante para liberar as proteínas ligadas às esferas. Adicione 10 microlitros do tampão desnaturante do kit endo H ao pellet de esferas e ferva as amostras por cinco minutos. Centrifugue novamente as esferas e transfira o sobrenatante para um novo tubo EOR.

As proteínas ellu estão agora prontas para desglicosilação. Os glicanos são liberados tanto das amostras de IP quanto das amostras totais de proteína utilizando a enzima e OH. Para as amostras de IP, adicione 0,5 microlitros da enzima endo H a cada amostra juntamente com 10 microlitros do tampão de reação endo H 2x. Incube as amostras a 37 graus Celsius por três horas.

Para glicoproteínas totais, aplique o sobrenadante dos lisados celulares a um filtro MicroCon com corte de 30 kilodaltons. Lave o extrato de proteína total três vezes com 100 microlitros do tampão E por meio de centrifugações repetidas a 14.000 Gs por três minutos. Adicione três microlitros de tampão de reação 10x de endo H e 1,5 microlitro da enzima endo H ao MicroCon, onde as proteínas lavadas permanecem, e incube por três horas a 37 graus Celsius junto com as amostras de IP.

Após o término da incubação de três horas, dilua a amostra de IP cinco vezes com água desionizada e coloque sobre um novo filtro MicroCon, centrifugando a 14.000 Gs por três minutos. Prossiga com a lavagem das amostras de IP e de proteína total aplicando 50 microlitros de água desionizada e centrifugando as amostras. Repita o processo mais duas vezes. Mantenha o fluxo que contém os glicanos clivados, se desejado, através de Tates contendo glicoproteínas resistentes à endo H. Em seguida, as glicoproteínas são incubadas com 200 unidades milimolares de N-glicosidase F em 15 microlitros do tampão C a 37 graus Celsius por 16 horas.

A eluição com água desionizada é realizada conforme acabou de ser mostrado. Seque completamente as amostras utilizando um concentrador de vácuo com aquecimento até 45 graus Celsius para acelerar o processo. Re-suspenda os pellets secos em 12 microlitros do solvente de CLAE e carregue as amostras em uma coluna sphe ou amino instalada no equipamento de CLAE.

Execute as amostras conforme descrito no protocolo escrito em anexo. Colete 48 frações para cada corrida de amostra. Utilize um contador cintilante para medir os valores de CPM das frações coletadas e trace a leitura de CPM em função do número da fração.

Calcule a porcentagem de resíduos de manos de todas as espécies de glicanos conforme descrito no protocolo escrito acompanhante. Abaixo estão resultados representativos da análise de cadeias de açúcar de glicoproteínas totais de uma amostra com marcação por pulso de uma hora. A leitura de CPM das frações de CLAE é representada em função do número da fração no perfil resultante.

Em cada pico representa uma espécie específica de glicano identificada por uma corrida de HPLC com padrões de glicanos conhecidos. Para cada espécie de glicano, sua porcentagem molar em relação ao total de glicanos é representada graficamente em função do tempo de chase. O tempo mostrado aqui é uma análise desse tipo para uma glicoproteína mal dobrada específica isolada por imunoprecipitação a partir de uma amostra tratada com o inibidor do proteassoma MG 132.

A espécie de glicano aparado M cinco seis se acumula durante o período de chasing, levando à conclusão de que os oligossacarídeos presentes em uma proteína mal dobrada sofrem extenso aparo de manose antes da degradação. Isso contrasta com os oligossacarídeos presentes em glicoproteínas totais de amostras tratadas da mesma forma. Aqui, M nove oito permanece a principal espécie de glicano durante o chasing, com apenas um pequeno aumento na quantidade de M cinco seis. Isso leva à conclusão de que apenas uma pequena fração do pool total de glicoproteínas é direcionada para a degradação de proteínas associada ao retículo endoplasmático.

Rad. abreviado. Conforme explicado mais detalhadamente no protocolo escrito que acompanha, acabamos de mostrar como usar uma combinação de palase em células vivas e análise por CLAE para acompanhar a dinâmica da composição de oligossacarídeos não ligados durante a vida de uma glicoproteína. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar de evitar contaminações das amostras de "chase" com traços de meios radioativos, o que resultaria na marcação indesejada dos glicanos durante os períodos de "chase" na separação por tamanho.

É também importante ajustar a CLAE a uma pressão constante para garantir a consistência da fracionamento dos glicanos. É isso aí. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.