Análise imunocitoquímica de células-tronco humanas pluripotentes usando um Self-Made Aparelho Cytospin

Resumo

Suspensão coloração imunocitoquímica de células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) para marcadores da superfície celular (SSEA-3/SSEA-4) foi alcançada com base na utilização de um aparelho cytospin self-made para criar uma monocamada de células para observação e quantificação.

Resumo

Células pluripotentes estaminais humanas (hPSCs) que incluem células estaminais embrionárias humanas (hESCs) e células-tronco pluripotentes induzidas (hiPSCs) são fontes de células emocionante devido à sua ilimitada capacidade de auto-renovação e seu potencial de se diferenciar em vários tipos de células. O estado de pluripotentes hPSCs é tipicamente avaliada por técnicas tais como qPCR, imunocitoquímica, e por outros

Protocolo

Parte 1: Coloração Suspensão imunocitoquímico

1. As células são colhidas em uma suspensão de células individuais.
2. As células são então transferidos para um tubo de microcentrífuga de 1,5 2mL e centrifugado a 200g por 4 minutos.
3. As células são lavadas por aspiração fora sobrenadante, re-suspensas em 1mL de PBS - (sem Mg ^{2 +} e Ca ^{2 +)} e depois centrifugada novamente a 200g por 4 minutos. Isto deve ser feito duas vezes.
4. Após a lavagem, as células são então fixado pelo re-suspendendo-as em 1mL de 4% paraformaldeído (PFA) em temperatura ambiente por 10 minutos.
5. As células são lavadas novamente duas vezes com 1mL de PBS -.
6. Depois de células de lavar roupa, bloco por re-suspendendo-as em 1 ml de solução de bloco (6% serum/94% PBS -). Incubar esses em temperatura ambiente por 45 minutos.
7. Após, centrifugar tubos de 200g por 4 minutos e aspirar a Solução Block. Re-suspender as células em 1mL da solução de anticorpo primário (feito com solução de Bloco na diluição recomendada). As células podem ser incubadas em temperatura ambiente por 1 hora ou a 4 ° C durante a noite antes de prosseguir para a próxima etapa.
8. Células são então lavadas duas vezes com 1 ml de solução Block.
9. Depois, volte a suspender as células em 1mL de solução de anticorpo secundário (feito com solução de Bloco na diluição recomendada) e incubar à temperatura ambiente por 1 hora.
10. Depois de uma hora, as células devem ser lavadas novamente duas vezes com 1 ml de solução Block.
11. Após a lavagem com solução de Bloco, lave as células novamente com 1mL de PBS -.
12. Após as lavagens diversas, re-suspender as células em 1mL de DAPI nuclear mancha (diluição de 1:10.000 em PBS DAPI -) e incubar à temperatura ambiente por 5 minutos.
13. Após 5 minutos, centrifugar tubos de 200g por 4 minutos. Aspirar a solução nuclear DAPI mancha e re-suspender as células em 1mL de PBS -.

Parte 2: Incorporação de hPSCs em slides gerados por aparelhos cytospin

1. Slides de plástico são preparados por fazer a quantidade desejada de furos com uma broca imprensa. O diâmetro deve ser no máximo um milímetro maior que o maior diâmetro da ponta da micropipeta (s) a ser utilizado.
2. Filtro de papel é cortado com os parâmetros da lâmina de plástico com uma tesoura.
3. Furos são feitos então no papel de filtro. O tamanho do buraco (s) deve ser grande o suficiente para que a ponta micropipeta (s) se encaixa confortavelmente através dele.
4. Depois, um dos slides de plástico preparado é colocado na parte superior e uma lâmina de vidro na colocados na parte inferior do papel filtro de corte (Figura 1). As camadas são fixados com fita adesiva.
5. Um máximo de 100μL (dependendo da densidade desejada monocamada) da suspensão de células coradas da Parte 1 é então colocado no topo da ponta da micropipeta (s).
6. Se necessário, o aparelho com a solução de célula pode ser pesado e um contrapeso de peso semelhante criado.
7. O aparelho cytospin e contrapeso pode são então colocados em uma centrífuga de mesa e centrifugado a 200g por 4 minutos.
8. Após a centrifugação, o aparelho é cuidadosamente desmontado cytospin de uma forma que doesnt desalojar as células da lâmina de vidro.
9. Se necessário, o excesso de PBS redor - do lado de vidro em aspirados para fora.
10. As células podem ser visualizados usando um microscópio de fluorescência para verificar se a monocamada de células desejado foi alcançado.

Parte 3: slides de montagem

1. A queda dos meios de comunicação de montagem desejada é colocado diretamente no centro de cada área contendo células.
2. Depois, a lamínula é suavemente baixou para os slides tentando evitar as bolhas de ar, se possível.
3. Excesso de meios de montagem é então removido do slides.
4. Depois, os lados do lamínulas são selados com verniz.
5. Os slides podem ser mantidos em uma área de armazenamento escuro até que os resultados são observados e documentados.

Discussão

Para efeitos do nosso laboratório, um prato de 35 milímetros de culturas de células-tronco cultivadas em fibroblastos de rato embrionárias (MEFs) é alocado para o procedimento de coloração imunocitoquímica para uso com o aparelho cytospin. As células são então coletados por meio de passaging enzimática, removendo o máximo da camada de MEF quanto possível, em uma suspensão de uma única célula. Se mais de isolamento de células-tronco eficaz a partir da camada MEF é desejada, as colônias podem ser manualmente escolheu entã...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Lab Tek Permanox Corrediça de Câmara	Thermo Fisher Scientific, Inc.	117437	Material para lâminas de plástico reutilizadas
Superfrost/Plus Lâminas de Microscópio Pré-limpas	Fisher Scientific	12-550-15
0.1-10μ L Dicas de Filtro	USA Scientific, Inc.	1121-3810
Vidro de Cobertura de Microscópio	Fisher Scientific	120542-B
Cytoseal 280	Richard-Allan Scientific	8311-4	Meio de Montagem
DPBS	GIBCO, por Life Technologies	14190
Soro de Cabra Normal	Invitrogen	10000C
Anticorpo Monoclonal de Camundongo Anti-SSEA-4	EMD Millipore	MAB4304	Anticorpo primário para coloração SSEA-4
Anticorpo monoclonal anti-SSEA-3 de rato	EMD Millipore	MAB4303	anticorpo primário para coloração SSEA-3
Alexa Fluor 488 Cabra Anti-rato IgG	Invitrogen	A11029	Anticorpo secundário para coloração SSEA-4
Alexa Fluor 488 Rotulado Cabra Anti-Rato IgG	Invitrogen	A11006	Anticorpo Secundário para coloração
SSEA-3DAPI, 268298			de calbioquímica