Artigo de método

Análise imunocitoquímica de células-tronco humanas pluripotentes usando um Self-Made Aparelho Cytospin

DOI:

10.3791/1944

⸱

9 de abril de 2010

 ,  , 
1Department of Chemical and Life Sciences Engineering, Virginia Commonwealth University

Neste artigo

Resumo

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Suspensão coloração imunocitoquímica de células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) para marcadores da superfície celular (SSEA-3/SSEA-4) foi alcançada com base na utilização de um aparelho cytospin self-made para criar uma monocamada de células para observação e quantificação.

Resumo

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Células pluripotentes estaminais humanas (hPSCs) que incluem células estaminais embrionárias humanas (hESCs) e células-tronco pluripotentes induzidas (hiPSCs) são fontes de células emocionante devido à sua ilimitada capacidade de auto-renovação e seu potencial de se diferenciar em vários tipos de células. O estado de pluripotentes hPSCs é tipicamente avaliada por técnicas tais como qPCR, imunocitoquímica, e por outros

Protocolo

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Parte 1: Coloração Suspensão imunocitoquímico

  1. As células são colhidas em uma suspensão de células individuais.
  2. As células são então transferidos para um tubo de microcentrífuga de 1,5 2mL e centrifugado a 200g por 4 minutos.
  3. As células são lavadas por aspiração fora sobrenadante, re-suspensas em 1mL de PBS - (sem Mg 2 + e Ca 2 +) e depois centrifugada novamente a 200g por 4 minutos. Isto deve ser feito duas vezes.
  4. Após a lavagem, as células são então fixado pelo re-suspendendo-as em 1mL de 4% paraformaldeído (PFA) em temperatura ambiente por 10 minutos.
  5. As células são lavadas novamente duas veze....

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Discussão

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Para efeitos do nosso laboratório, um prato de 35 milímetros de culturas de células-tronco cultivadas em fibroblastos de rato embrionárias (MEFs) é alocado para o procedimento de coloração imunocitoquímica para uso com o aparelho cytospin. As células são então coletados por meio de passaging enzimática, removendo o máximo da camada de MEF quanto possível, em uma suspensão de uma única célula. Se mais de isolamento de células-tronco eficaz a partir da camada MEF é desejada, as colônias podem ser manualmente escolheu entã.......

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Divulgações

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Não há conflitos de interesse declarados.

Agradecimentos

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Financiamento parcial para este trabalho foi fornecida pela NSF CARREIRA-0744556 (Rao) e uma bolsa de estudos através do VCU-HHMI Ciências da Educação e Programa de Pesquisa (Pascual).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Lab Tek Permanox Corrediça de CâmaraThermo Fisher Scientific, Inc.117437Material para lâminas de plástico reutilizadas
Superfrost/Plus Lâminas de Microscópio Pré-limpasFisher Scientific12-550-15
0.1-10μ L Dicas de FiltroUSA Scientific, Inc.1121-3810
Vidro de Cobertura de MicroscópioFisher Scientific120542-B
Cytoseal 280Richard-Allan Scientific8311-4Meio de Montagem
DPBSGIBCO, por Life Technologies14190
Soro de Cabra NormalInvitrogen10000C
Anticorpo Monoclonal de Camundongo Anti-SSEA-4EMD MilliporeMAB4304Anticorpo primário para coloração SSEA-4
Anticorpo monoclonal anti-SSEA-3 de ratoEMD MilliporeMAB4303anticorpo primário para coloração SSEA-3
Alexa Fluor 488 Cabra Anti-rato IgGInvitrogenA11029Anticorpo secundário para coloração SSEA-4
Alexa Fluor 488 Rotulado Cabra Anti-Rato IgG InvitrogenA11006Anticorpo Secundário para coloração
SSEA-3DAPI, 268298de calbioquímica
de dicloridrato

Referências

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  1. Rao, R. R., Johnson, A. V., Stice, S. L. Cell surface markers in human embryonic stem cells. Methods in Mol. Bio. - Stem Cell Assays. 407, 51-61 (2007).
  2. Sisino, G., Bellavia, D., Corallo, M., Geraci, F., Barbieri, R. A homemade cytospin apparatus. Anal. Biochem. 359, 283-284 (200....

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Etiquetas

Human Pluripotent Stem CellsImmunocytochemical AnalysisSelf Made Cytospin ApparatusCell Surface MarkersFlow CytometryStem Cell DifferentiationSSEA3 SSEA4 MarkersMonolayer Cell PreparationCytospin CentrifugationImmunostaining Protocol

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