Crônico Salmonella Modelo de camundongos infectados

Resumo

Estabelecer um modelo de camundongo bacteriana crônica infectados com persistente Salmonella Typhimurium colonização no intestino durante 27 semanas.

Resumo

O modelo do rato infectado de bactérias é um sistema poderoso modelo para o estudo de áreas tais como inflamação, infecção, imunologia, transdução de sinal, e tumorigênese. Muitos pesquisadores têm se aproveitado da colite induzida por

Protocolo

Este protocolo inclui três partes: detecção de cultura bacteriana, gavage mouse, e Salmonella.

1. Condições de crescimento Salmonella.

1. Prepare a Salmonella Luria-Bertani caldo de placa (LB), incubar a 37 ° C durante a noite.
2. Escolha um clone da placa de LB e colocar em 7 LB ml em um tubo de 12 ml, e agitar a 37 ° C por cerca de 5 horas.
3. Inocular 50 ml LB com 0,05 ml de uma cultura de fase estacionária e incubar a 37 ° C sem agitação por cerca de 18 horas.
4. Rotação de cultura bacteriana durante a noite a temperatura ambiente com 6000 rpm por 10 minutos, suspender as bactérias em HBSS usando 100:3 ratio (LB: HBSS). Por exemplo:
   Cada cultura LB 50 ml será suspenso em 1,5 ml HBSS.
5. Para a sonda animal, diluir a cultura bacteriana na proporção de 1:10. Por exemplo:
   A cada 1,5 ml de cultura LB será suspenso em 15 ml HBSS.

2. Salmonella modelo de infecção *.

1. Preparar a solução de estreptomicina. Cada rato será dado 7,5 mg de estreptomicina em 100 mL HBSS. Por exemplo, prepare mg 90 total de estreptomicina, em 1,2 ml de HBSS 10 ratos. Sempre tem algum volume extra na preparação da solução de estreptomicina.
2. Retirar água e comida 4 horas antes do tratamento gavagem oral.
3. Camundongos gavagem com estreptomicina com 7,5 mg de estreptomicina (100 l de HBSS para os ratos de controle). Agarre a pele sobre o ombro do mouse firmemente com o polegar eo dedo médio, esticar a cabeça e pescoço com o dedo indicador para fazer o esôfago em linha reta. Dirigir a bola ponta da agulha de alimentação ao longo do céu da boca e em direção ao lado direito da parte de trás da faringe, em seguida, delicadamente passar para dentro do esôfago e injetar a solução de 100 ml. Nenhuma resistência deve ser sentida.
4. Menos 20 horas após o tratamento estreptomicina, água e alimentos retirados novamente antes de os camundongos são infectados com bactérias.
5. Gavagem cada rato com 100 mL de suspensão em HBSS ou tratados com HBSS estéril (controle) por gavagem oral. O procedimento de gavagem é o mesmo que 2.3) ratos gavage com estreptomicina.

Experimentos em animais * foram realizadas utilizando-específicas isentos de agentes patogénicos C57BL feminino / 6 camundongos (Taconic, Hudson, NY), que foram 6-7 semanas de idade, como descrito anteriormente ^1. O protocolo foi aprovado pela Universidade de Rochester University Comité de Recursos Animal (UCAR).

3. Detecção de Salmonella no intestino.

1. Coletar rato fecal (cerca de 100 mg).
2. Transferência da amostra fecal a um tubo de centrífuga de 1,5 micro com 1ml de PBS e vortex vigorosamente.
3. Centrifugar por 10 min a 800 rpm. Transferir o sobrenadante para um tubo de microcentrífuga limpo.
4. Centrifugação a 6000 rpm por 5 min. Sobrenadante é descartado e 200 mL PBS é adicionado à pellets e agitadas.
5. Raia o PBS 200 mL com um espalhador de células em um prato descartável CHROMagar BBL para detectar Salmonella. Espécies Salmonella aparecem malva (rosa ao roxo, ver Fig.1). Se 200 mL rende muitas colônias na placa, use 100 ml ou 50 ul para a raia.

4. Resultados representante.

Quando o protocolo é feito corretamente, a colonização de Salmonella typhimurium pode ser detectado no intestino do rato mais de 6 meses. Salmonella pode ser detectado por cultura fecal mais de 6 meses (Fig.1). Como fora típico vêm deste modelo, o corpo de emagrecimento e morte ocorrer dentro de 4 semanas após a infecção. Dependente do Cepas de Salmonella usado para infecção, alguns ratos não podem sobreviver mais de 6 meses.

Figura 1. Salmonella intestinal na espécie Salmonella aparecem malva (rosa ao roxo) na cor, devido às diferenças metabólicas na presença de cromógenos selecionado. Outras bactérias são inibido ou produzir colônias azul-esverdeada ou incolor.

Figura 2. Proporções de sobrevivência de camundongos infectados com Salmonella cepa mutante PhoP ^{c, c} PhoP Avra, e PhoP AvrA-/AvrA ^c +, ^c PhoP Avra durante 4 semanas (28 dias).

Tabela peso corporal 1. De camundongos infectados com Salmonella durante 4 semanas.

	0	1 semana	2 semanas	3 semanas	4 semanas
controle	16,78 ± 1,05	16,91 ± 1,28	18,26 ± 1,23	19,31 ± 1,26	20,26 ± 1,15
PhoP c	17,14 ± 1,19	17,43 ± 1,63 *	18,68 ± 1,78	20,05 ± 1,11
PhoP c Avra-	16,91 ± 1,12	16,96 ± 1,39	17,06 ± 2,14 **	18,71 ± 2,18	20,15 ± 1,56
PhoP c + AvrA-/AvrA	16,94 ± 0,96	17,17 ± 1,02	17,63 ± 1,42 *	18,44 ± 2,03	20,09 ± 1,17

16,89 ± 1,03

* Comparado ao grupo controle p <0,05
** Quando comparado ao grupo controle p <0,01

Tabela 2. Cepas de Salmonella utilizados neste estudo.

Nome	Descrição	De referência ou fonte
Salmonella 14028s	Do tipo selvagem S. typhimurium	ATCC
PhoP c	Não-patogênicos complexo regulador mutante	Miller et al., 1990
PhoP c Avra-	Avra mutação	Collier-Hyams et al., 2002
PhoP c + AvrA-/AvrA	PhoP c Avra com Avra codificação complementada plasmídeo	Collier-Hyams et al., 2002

Discussão

Para utilizar este sistema, é necessário que o pesquisador para aprender a gavagem os animais. Detalhamos uma metodologia para preparar a cultura bacteriana e gavagem a camundongos. Também mostramos como monitorar a persistência de Salmonella no trato gastrointestinal (TGI). Os passos críticos neste protocolo, incluindo:

1. Estreptomicina pré-tratamento: Estreptomicina pré-tratamento, poderia se livrar de alguns comensais da flora intestinal e fazer os ratos suscetíveis à infecção por Salmonella

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
HBSS	Sigma-Aldrich	ABCD1234
Caldo Luria-Bertani	BD Biosciences	244610
Agulha de alimentação	Popper & Sons, Inc.	7920
Streptomycin	MP Biomedicals	100556
BBL CHROMagar Salmonella	BD Biosciences	214983
Espalhadores celulares descartáveis	Biologix Research Company	65-1010