Aptâmeros são ribo-/deoxyribo-oligonucleotides curtas selecionados por In-vitro Métodos de evolução com base na afinidade por um alvo específico. Aptâmeros são ferramentas de reconhecimento molecular com o versátil aplicações terapêuticas, de diagnóstico e pesquisa. Demonstramos métodos de selecção dos aptâmeros para a proteína β-amilóide, o agente causador da doença de Alzheimer.
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Artigo de método
Seleção de Aptamers para proteína β-amilóide, o agente causador da doença de Alzheimer
Neste artigo
Resumo
Resumo
Doença de Alzheimer (DA) é uma progressiva, dependente da idade desordem, neurodegenerativas com um curso insidioso que torna seu diagnóstico pré-sintomático difícil 1. AD diagnóstico definitivo é obtido post-mortem só, estabelecendo assim o diagnóstico, pré-sintomático precoce da AD é crucial para o desenvolvimento e administração de terapias eficazes 2,3.
Β-amilóide-proteína (Aâ) é central para a patogênese AD. Solúvel, oligomérica assembléias Aâ Acredita-se que afetam a disfunção subjacente neurotoxicidade sináptica e perda de neurônios na AD 4,5. Várias formas de assembléias Aâ solúveis têm sido descritos, no entanto, suas inter-relações e relevância para a etiologia e patogenia AD são complexas e não bem compreendido 6. Ferramentas específicas de reconhecimento molecular pode desvendar as relações entre os conjuntos Aâ e facilitar a detecção e caracterização destes conjuntos no início do curso da doença antes que os sintomas surjam. Reconhecimento molecular comumente se baseia em anticorpos. No entanto, uma classe alternativa de ferramentas de reconhecimento molecular, aptâmeros, oferece vantagens importantes em relação aos anticorpos 7,8. Aptâmeros são oligonucleotides gerados por in-vitro de seleção: a evolução sistemática de ligantes por enriquecimento exponencial (SELEX) 9,10. SELEX é um processo iterativo que, semelhante à evolução darwinista, permite a amplificação de seleção, o enriquecimento, ea perpetuação de uma propriedade, por exemplo, ávido, específico, ligante de ligação (aptâmeros) ou atividade catalítica (ribozimas e DNAzymes).
Apesar da emergência de aptâmeros como ferramentas em biotecnologia moderna e da medicina 11, eles têm sido subutilizados no campo amilóide. RNA poucos ou aptâmeros ssDNA foram selecionados contra diversas formas da proteína príon (PrP) 12-16. Um aptamer RNA recombinante contra gerada PrP bovina foi mostrado para reconhecer bovina PrP-β 17, um solúvel, oligomérica, β-folhas ricas variante conformacional de full-length PrP que forma fibrilas amilóides 18. Aptâmeros gerados usando formas monomérica e vários de β fibrilar 2-microglobulina (β 2 m) foram encontradas para ligar fibrilas de algumas outras proteínas amiloidogênicas além β 2 m fibrilas 19. Ylera et al. descrito aptâmeros RNA selecionada imobilizada contra monomérica Aβ40 20. Inesperadamente, esses aptâmeros ligado fibrilar Aβ40. Em conjunto, esses dados levantam várias questões importantes. Por que aptâmeros selecionados contra proteínas monoméricas reconhecer suas formas poliméricas? Poderia aptâmeros contra as formas monoméricas e / ou de proteínas oligoméricas amiloidogênicas ser obtido? Para responder a essas questões, buscou-se selecionar aptâmeros para covalentemente estabilizado oligomérica Aβ40 21 gerados usando foto-induzida cross-linking de proteínas não modificadas (picup) 22,23. Similar aos resultados anteriores 17,19,20, esses aptâmeros reagiu com fibrilas de Aâ e várias outras proteínas amiloidogênicas provável o reconhecimento de um amilóide potencialmente estrutural comum aptatope 21. Aqui, apresentamos a metodologia SELEX utilizados na produção destes aptâmeros 21.
Protocolo
Parte 1: preparação de proteína e cross-linking
Inicialmente, a proteína usada para SELEX é pré-tratados com 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP) para obter homogênea, agregar-free preparações, como descrito anteriormente 23. Esta etapa é necessária porque pré-formados agregados induzir a agregação rápida de proteínas amiloidogênicas, resultando em reprodutibilidade experimental pobres 24, e são indesejáveis para a seleção de aptâmeros para desagregados, não-fibrilar formas da proteína.
- Pesar ~ mcg 800 (~ 180 nmol) pura Aβ40 usando uma microbalança. Transferência do peptídeo seco liofilizado em rotul....
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Discussão
O ponto de partida do processo SELEX é a síntese de uma biblioteca de oligonucleotídeos aleatórios tipicamente contendo 10 12 -10 15 seqüências. No DNA SELEX, esta biblioteca é usada diretamente depois de um pool de ssDNA é gerada, enquanto que no RNA SELEX, demonstrado aqui, a biblioteca ssDNA é convertido primeiro a um pool de RNA enzimaticamente por in-vitro de transcrição. Então, é realizada iterativamente SELEX que cada ciclo compõe a exposição e ligação de oligonucleotídeos para o al.......
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Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
Este trabalho foi suportado por concessões de NIH AG030709 / NIA e 07-65798 do Departamento de Saúde Pública da Califórnia. Reconhecemos Margaret M. Condron para peptídeo síntese e análise de aminoácidos, Dr. Elizabeth Neufeld F. para ajudar e apoiar os passos iniciais do projeto, Dr. Chi-Hong B. Chen para dar suporte e reagentes, e André, Dr. D . Ellington para discussões úteis.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Aβ40 | UCLA Biopolymers Laboratory | Pó liofilizado | |
| Microbalança Automatizada MX5 | Mettler Toledo | ||
| Tubos de 1,6 ml revestidos com silicone | Denville Scientific | C19033 ou C19035 | |
| 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP) | TCI America | H0424 | Utilizar em capela de exaustão. |
| Persulfato de amônio | Sigma-Aldrich | A-7460 | Vortex até a solução ficar límpida. O APS é preparado fresco a cada uso e deve ser utilizado dentro de 48 h. |
| Tris(2,2-bipiridil)diclororutênio(II) hexaidratado | Sigma-Aldrich | 224758-1G | Vortex até a solução ficar límpida. Cubra o tubo de RuBpy com papel alumínio para proteger o reagente da luz ambiente. O RuBpy é preparado fresco a cada uso e deve ser utilizado dentro de 48 h. |
| Ditiotreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 43815 | |
| Colunas desaladoras D-Salt™ Excellulose™ | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 20449 | |
| Acetato de amônio | Fisher Scientific | A637-500 | |
| Tubos de 0,6 ml revestidos com silicone | Denville Scientific | C19063 | |
| Géis Novex Tricine (10–20%) | Invitrogen | EC6625B0X | 10 poços; tamanho mini (8 cm X 8 cm); volume de carga de 25 μl por poço; faixa de separação de 5 kDa a 40 kDa |
| Cubeta de quartzo | Hellma | 105.250-QS | |
| Espectrofotômetro Beckman DU 640 | Beckman Coulter Inc. | ||
| Biblioteca de ssDNA | Integrated DNA Technologies | Encomendado sob medida | A biblioteca foi projetada para conter 49 nucleotídeos aleatórios flanqueados por duas regiões constantes contendo sítios de ligação de iniciadores e clonagem: 5’-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA ATT CCG CGT GTG C (N:25:25:25:25%) (N)49 G TCC GTT CGG GAT CCT C-3’ |
| Polimerase Taq de DNA | USB Corp., Affymetrix | 71160 | Polimerase de DNA recombinante Thermus aquaticus fornecida com tampão PCR 10× e um tubo separado de MgCl2 25 mM para PCR rotineira. |
| Mistura de nucleotídeos para PCR, solução 10 mM | USB Corp., Affymetrix | 77212 | (10 mM cada de dATP, dCTP, dGTP, dTTP) |
| Primer direto | Integrated DNA Technologies | Encomendado sob medida | 5’-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA ATT CCG CGT GTG C-3’ |
| Primer reverso | Integrated DNA Technologies | Encomendado sob medida | 5’-GAG GAT CCC GAA CGG AC-3’ |
| Ciclador térmico | Denville Scientific | Techne TC-312 | |
| Kit QIAquick de Purificação de PCR (50) | Qiagen | 28104 | |
| Agarose | Denville Scientific | CA3510-8 | |
| Tubos cônico estéreis de 1,6 ml com tampas fixadas por anéis O | Denville Scientific | C19040-S | |
| Sistema RiboMAX™ de Produção em Grande Escala de RNA–T7 | Promega Corp. | P1300 | O kit contém: 120 μl de Mistura Enzimática (polimerase de RNA, inibidor recombinante de ribonuclease RNasin® e pirofosfatase inorgânica recombinante); 240 μl de tampão de transcrição 5×; 100 μl de cada um dos 4 rNTPs, 100 mM; 110 U de DNase livre de RNase RQ1, 1 U/μl; 10 μl de DNA controle linear, 1 mg/ml; 1 ml de acetato de sódio 3M (pH 5,2); 1,25 ml de água livre de nucleases |
| α-32P-citidina 5’-trifosfato, 250 μCi (9,25 MBq), | PerkinElmer, Inc. | BLU008H250UC | Atividade específica: 3000 Ci (111 TBq)/mmol, 50 mM Tricina (pH 7,6) |
| Fenol saturado com citrato:clorofórmio:álcool isoamílico (125:24:1, pH 4,7) | Sigma-Aldrich | 77619 | |
| Clorofórmio:álcool isoamílico (24:1) | Sigma-Aldrich | C0549 | |
| Etanol absoluto para biologia molecular | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Microcentrífuga refrigerada Z216-MK | Denville Scientific | C0216-MK | |
| Colunas Micro illustra ProbeQuant™ G-50 | GE Healthcare | Obtido da Fisher Scientific (45-001-487) | Pré-embaladas com Sephadex™ G-50 grau DNA e pré-equilibradas em tampão STE contendo 0,15% de Kathon como biocida |
| Contador de cintilação de bancada Triathler | Hidex Oy, Turku, Finlândia | Modelo Triathler LSC: 425-034 | |
| Tampão amostral Novex® TBE-Ureia (2×) | Invitrogen | LC6876 | |
| Géis 6% TBE-Ureia, 1,0 mm, 10 poços | Invitrogen | EC6865BOX | |
| Tampão de corrida Novex® TBE (5×) | Invitrogen | LC6675 | |
| Descontaminante de radioatividade | Fisher Scientific | 04-355-67 | |
| Pontas para carregamento de géis | Denville Scientific | P3080 | |
| Célula Mini XCell SureLock | Invitrogen | EI0001 | Célula Mini XCell SureLock |
| Filme de autorradiografia | Denville Scientific | E3018 | Utilizar em completa escuridão |
| Filme de autorradiografia, Hyperfilm™ ECL | Amersham | RPN3114K | Pode ser usado sob luz vermelha segura. |
| Discos de membrana | EMD Millipore | GSWP02500 | Membranas de ésteres de celulose mistos, hidrofílicas, 0,22-μm |
| Base de suporte de vidro fritado para frasco de 125 ml | VWR international | 26316-696 | |
| Placas de Petri | Fisher Scientific | 08-757-11YZ | |
| Ureia | Fisher Scientific | AC32738-0050 | |
| EDTA | Fisher Scientific | 118430010 | |
| Glicogênio | Sigma-Aldrich | G1767 | |
| 2-propanol para biologia molecular | Sigma-Aldrich | I9516 | |
| Inibidor recombinante de RNase | USB Corp., Affymetrix | 71571 | |
| Sistema de Transcrição Reversa ImProm-II™ | Promega Corp. | A3802 | |
| Inibidor recombinante de RNase | USB Corp., Affymetrix | 71571 | |
| Corante de carregamento RapidRun™ | USB Corp., Affymetrix | 77524 |
Referências
- Monien, B. H., Apostolova, L. G., Bitan, G. Early diagnostics and therapeutics for Alzheimer's disease-how early can we get there. Expert. Rev. Neurother. 6, 1293-1306 (2006).
- Nestor, P. J., Scheltens, P., Hodges, J. R. Advances in the early detection of Alzheimer's d....
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Reimpressões e permissões
