Bimolecular de fluorescência de Complementação Assay (BiFC) para Interação Proteína-Proteína em células de cebola Utilizando o Gene Gun Helios

Summary

Este artigo ilustra como usar corretamente o BioRad Helios Gene Gun para introduzir DNA plasmidial em células epidérmicas de cebola e como testar para interações proteína-proteína em células de cebola com base no princípio de Complementação de fluorescência Bimolecular (BiFC)

Abstract

Investigação da função dos genes em diversos organismos baseia-se no conhecimento de como os produtos de genes interagem uns com os outros em seu ambiente normal de celular. O Bimolecular Fluorescência de Complementação Assay (BiFC)

Protocol

I. preparação Plasmid

O DNA plasmídeo usado para bombardeio deve ser de alta pureza e em uma concentração de 500ng/μl ou superior. Para BiFC envolvendo duas construções plasmídeo, 25 mcg de cada plasmídeo é necessário. Em outras palavras, 1:1 molar dos dois plasmídeos devem ser misturadas para dar origem a 50 mg DNA total plasmídeo para a preparação de cartuchos. Esteja consciente de que a adição de mais DNA do que 50 mg pode causar aglomeração das partículas de ouro e deve ser evitado. Comercialmente disponíveis kits de extração de DNA plasmídeo são recomendados para isolar DNA plasmídeo.

Vetores plasmídeo deve....

Discussion

1. Para usuários de primeira vez, recomendamos a prática de todo o processo, desde a preparação do cartucho para observação, com um plasmídeo repórter única constitutiva, como 35S:: GFP ou 35S:: GUS. Usamos um 35S:: GFP plasmídeo obtido a partir de drs. Steve Monte e Zhang Xiaoning ⁶ (Figura 1A, D). O gene cartuchos de tiro controle vendido a RioRad (Cat 165-2244) não são adequados para as plantas.
2. Para BiFC, um segundo controle positivo é necessário, que deve ser composto de dois conhecidos parceiros interagindo fund.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cebola amarela	Qualquer fornecedor
Helios Gene Gun	Bio-Rad
Microscópio fluorescente com filtros apropriados para GFP ou YFP	Zeiss, Nikon, Olympus