Este artigo ilustra como usar corretamente o BioRad Helios Gene Gun para introduzir DNA plasmidial em células epidérmicas de cebola e como testar para interações proteína-proteína em células de cebola com base no princípio de Complementação de fluorescência Bimolecular (BiFC)
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Artigo de método
Bimolecular de fluorescência de Complementação Assay (BiFC) para Interação Proteína-Proteína em células de cebola Utilizando o Gene Gun Helios
Neste artigo
Resumo
Resumo
Investigação da função dos genes em diversos organismos baseia-se no conhecimento de como os produtos de genes interagem uns com os outros em seu ambiente normal de celular. O Bimolecular Fluorescência de Complementação Assay (BiFC)
Protocolo
I. preparação Plasmid
O DNA plasmídeo usado para bombardeio deve ser de alta pureza e em uma concentração de 500ng/μl ou superior. Para BiFC envolvendo duas construções plasmídeo, 25 mcg de cada plasmídeo é necessário. Em outras palavras, 1:1 molar dos dois plasmídeos devem ser misturadas para dar origem a 50 mg DNA total plasmídeo para a preparação de cartuchos. Esteja consciente de que a adição de mais DNA do que 50 mg pode causar aglomeração das partículas de ouro e deve ser evitado. Comercialmente disponíveis kits de extração de DNA plasmídeo são recomendados para isolar DNA plasmídeo.
Vetores plasmídeo deve....
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Discussão
- Para usuários de primeira vez, recomendamos a prática de todo o processo, desde a preparação do cartucho para observação, com um plasmídeo repórter única constitutiva, como 35S:: GFP ou 35S:: GUS. Usamos um 35S:: GFP plasmídeo obtido a partir de drs. Steve Monte e Zhang Xiaoning 6 (Figura 1A, D). O gene cartuchos de tiro controle vendido a RioRad (Cat 165-2244) não são adequados para as plantas.
- Para BiFC, um segundo controle positivo é necessário, que deve ser composto de dois conhecidos parceiros interagindo fund.......
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Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
Agradecemos a drs. Steve Monte e Zhang Xiaoning para o 35S:: GFP pGlowbug construir e Doutorado da Irmandade Hokensen para CH Pesquisa em laboratório Z. L's é apoiado pela National Science Foundation EUA (IOB0616096 e MCB0744752). ZL é parcialmente financiado pela Universidade de Maryland Estação Experimental Agrícola.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Cebola amarela | Qualquer fornecedor | ||
| Canhão gênico Helios | Bio-Rad | ||
| Microscópio fluorescente com filtros apropriados para GFP ou YFP | Zeiss, Nikon, Olympus |
Referências
- Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation. Mol Cell. 9 (4), 789-789 (2002).
- Sitaraman, J., Bui, M., Liu, Z.
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Reimpressões e permissões
