Artigo de método

Bimolecular de fluorescência de Complementação Assay (BiFC) para Interação Proteína-Proteína em células de cebola Utilizando o Gene Gun Helios

DOI:

10.3791/1963

⸱

12 de junho de 2010

 , 
1Dept. Of Cell Biology and Molecular Genetics, University of Maryland

Neste artigo

Resumo

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Este artigo ilustra como usar corretamente o BioRad Helios Gene Gun para introduzir DNA plasmidial em células epidérmicas de cebola e como testar para interações proteína-proteína em células de cebola com base no princípio de Complementação de fluorescência Bimolecular (BiFC)

Resumo

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Investigação da função dos genes em diversos organismos baseia-se no conhecimento de como os produtos de genes interagem uns com os outros em seu ambiente normal de celular. O Bimolecular Fluorescência de Complementação Assay (BiFC)

Protocolo

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I. preparação Plasmid

O DNA plasmídeo usado para bombardeio deve ser de alta pureza e em uma concentração de 500ng/μl ou superior. Para BiFC envolvendo duas construções plasmídeo, 25 mcg de cada plasmídeo é necessário. Em outras palavras, 1:1 molar dos dois plasmídeos devem ser misturadas para dar origem a 50 mg DNA total plasmídeo para a preparação de cartuchos. Esteja consciente de que a adição de mais DNA do que 50 mg pode causar aglomeração das partículas de ouro e deve ser evitado. Comercialmente disponíveis kits de extração de DNA plasmídeo são recomendados para isolar DNA plasmídeo.

Vetores plasmídeo deve....

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Discussão

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  1. Para usuários de primeira vez, recomendamos a prática de todo o processo, desde a preparação do cartucho para observação, com um plasmídeo repórter única constitutiva, como 35S:: GFP ou 35S:: GUS. Usamos um 35S:: GFP plasmídeo obtido a partir de drs. Steve Monte e Zhang Xiaoning 6 (Figura 1A, D). O gene cartuchos de tiro controle vendido a RioRad (Cat 165-2244) não são adequados para as plantas.
  2. Para BiFC, um segundo controle positivo é necessário, que deve ser composto de dois conhecidos parceiros interagindo fund.......

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Divulgações

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Não há conflitos de interesse declarados.

Agradecimentos

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Agradecemos a drs. Steve Monte e Zhang Xiaoning para o 35S:: GFP pGlowbug construir e Doutorado da Irmandade Hokensen para CH Pesquisa em laboratório Z. L's é apoiado pela National Science Foundation EUA (IOB0616096 e MCB0744752). ZL é parcialmente financiado pela Universidade de Maryland Estação Experimental Agrícola.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Cebola amarelaQualquer fornecedor
Helios Gene GunBio-Rad
Microscópio fluorescente com filtros apropriados para GFP ou YFPZeiss, Nikon, Olympus

Referências

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  1. Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation. Mol Cell. 9 (4), 789-789 (2002).
  2. Sitaraman, J., Bui, M., Liu, Z.

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Etiquetas

Bimolecular Fluorescence ComplementationProtein Protein InteractionOnion Epidermal CellsHelios Gene GunFluorescence MicroscopyPlasmid BombardmentGold Particle CoatingSEU LUH InteractionYFP Fluorescence DetectionNegative Control Assay

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