O protocolo a seguir descreve o processo de dissecção pancreática para imagens fatia virtual, e posterior quantificação de todos os GFP-tagged células beta no pâncreas inteiro.
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Artigo de método
Quantificação em situ da Missa das células beta pancreáticas em camundongos
Neste artigo
Resumo
Resumo
Rastreamento alterações de populações de células específicas na saúde e na doença é um objetivo importante da pesquisa biomédica. O processo de proliferação de monitorização das células beta pancreáticas e crescimento das ilhotas é particularmente desafiador. Nós desenvolvemos um método para capturar a distribuição das células beta no pâncreas intacta de camundongos transgênicos com fluorescência marcadas beta-células com uma macro escrita para ImageJ (rsb.info.nih.gov / ij /). Após dissecção pancreática e limpeza de tecidos, o pâncreas inteiro é capturado como uma fatia virtual, após o que a GFP-tagged células-beta são examinados. A análise inclui a quantificação do total das células beta das ilhotas número área, e distribuição de tamanho com referência aos parâmetros e locais específicos para cada ilhota e para pequenos grupos de células-beta. Toda a distribuição das ilhotas podem ser plotados em três dimensões, e as informações a partir da distribuição do tamanho e da forma de cada ilhota permite uma comparação quantitativa e qualitativa das mudanças na área das células beta em geral num ápice.
Protocolo
Parte 1: Preparação de Amostras
- Colocar um mouse sob um microscópio de dissecação, remover o pâncreas inteiro junto com o duodeno eo baço ainda ligado, e colocar os órgãos numa lâmina de vidro pré-pesados. Remove o duodeno, cortando suas tecido conjuntivo ao longo do lado onde é ligado ao pâncreas. Cortar e remover o baço e excesso de gordura sobre o pâncreas até que o pâncreas é completamente isolado no slide. (Gordura pancreática é distinguível por sua cor branca, como diferenciada da cor ligeiramente mais escura e curtidor de tecido pancreático.)
- Coloque uma lamela (tampa de vidro grande 50x75mm; padrão tampa de vidro 25x75mm) sobre o pâncreas....
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Discussão
A análise de imagens Slice Virtual de ilhotas e células beta no pâncreas aglomerados intacto fornece uma visão em grande escala de toda a distribuição das ilhotas. Desenvolvimentos e mudanças na distribuição total de ilhotas ao longo do tempo pode assim ser estudados e comparados. Um exemplo é demonstrado em nossa análise de formação de ilhotas pancreáticas (1). Uma análise abrangente da pancreata ratos neonatal em momentos diferentes (P1-P21) demonstrou que ilhotas são formadas por fissão. Enquanto a proliferação de cé.......
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Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
O estudo é apoiado por EUA Public Health Service Grant DK-081527, 072473 e DK-DK-20595 para a Universidade de Chicago Diabetes Centro de Pesquisa e Treinamento (Core modelos animais), e um presente da Fundação Família Kovler.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Pinceta | Miltex Inc. | ||
| Tesoura | F.S.T. | 14001-13 | 01n2 |
| Tesoura | F.S.T. | 14072-10 | 02s5 |
| Lâmina de vidro grande | Electron Microscopy Sciences | 71862-01 | 75x51x1,2 mm |
| Cobertura de vidro grande | Ted Pella, Inc. | 260462 | 50x75 mm |
| Lâmina de vidro | Fisher Scientific | 12-550-15 | 25x75x1,0 mm |
| Cobertura de vidro | Fisher Scientific | 12-458-5M | 75x25 mm |
| Cobertura de vidro | Erie Scientific | círculo de 25 mm | |
| Microscópio fluorescente | Olympus Corporation | ||
| Microscópio de dissecação | Olympus Corporation | ||
| Stereo Investigator | MBF Bioscience | ||
| Murinos MIP-GFP | Jackson Laboratory |
Referências
- Miller, K., Kim, A., Kilimnik, G., Moka, U., Jo, J., Periwal, V., Hara, M. Islet formation during the neonatal development in mice. PloS One. 4, E7739-E7739 (2009).
- Kilimnik, G., Kim, A., Jo, J., Miller, K., Hara, M. Quantification of pancreatic islet distribution in situ in mice. ....
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Reimpressões e permissões
