Flash Freezing e Cryosectioning E12.5 cérebro de camundongo

Resumo

Demonstrado neste vídeo são as técnicas de congelamento instantâneo e secção tecido cerebral embrionário de rato. Dicas úteis para usar o criostato são dadas, incluindo métodos de solução de problemas que podem ser usados ​​durante o corte para garantir que as seções resultantes tecidos estão livres de rachaduras e outras distorções.

Protocolo

1. Fix tecido em paraformaldeído 4% em PBS para o tempo desejado.
2. Tecido sacarose infundir (crioproteção)
   1. Fazer solução de sacarose 30% em PBS w / v em 2059 tubo.
   2. Enxaguar tecido em 3x PBS (~ 5 min com balanço).
   3. Tecido lugar em solução de sacarose 30%. Tecido não vai afundar.
   4. Coloque o tecido em 4 ° C durante a noite, ou até que tenha afundado.
3. Tamanho da etiqueta apropriada cryomold com informação e orientação.
4. Preencha cryomold com outubro (evitar bolhas).
5. Transferência de tecido para outubro de banho e bata-a com outubro
6. Transferência de tecido para outubro em cryomold.
7. Orientar o tecido sob o microscópio.
8. Despeje nitrogênio líquido em placa de Petri de plástico.
9. Rápida e cuidadosamente inferior do tecido em cryomold no nitrogênio. (Não submergir o topo da cryomold.)
10. Quando o OCT é sólido branco, coloque o tecido congelado em freezer -80 ° C para armazenamento.
11. Equilibrar tecido para ~ 20 ° C por pelo menos 30 min. antes do corte.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Molde de criotomia Tissue-Tek	Ted Pella, Inc.	27181
O.C.T.	Ted Pella, Inc.	27050
Solução de sacarose			Solução de sacarose a 30% em PBS, peso/volume
paraformaldeído			Paraformaldeído a 4% em PBS