Preparação de Drosophila Células S2 para microscopia de luz

Resumo

Drosophila Schneider (S2), as células são um sistema cada vez mais popular para a descoberta e análise funcional de genes. Nosso objetivo é descrever algumas das técnicas microscópicas que formam células S2 tal sistema cada vez mais importante experimental.

Resumo

O sistema experimental ideal seria barato e fácil de manter, passíveis de uma variedade de técnicas, e seria apoiado por uma extensa literatura e banco de dados seqüência do genoma. Células cultivadas Drosophila S2, o produto de embriões disassociated 20-24 horas de idade ^1, possui todas essas propriedades. Conseqüentemente, as células S2 são extremamente bem adaptados para a análise de processos celulares, incluindo a descoberta de genes que codificam os componentes moleculares do processo ou mecanismo de interesse. As características de células S2 que são mais responsáveis ​​pela sua utilidade é a facilidade com que eles sejam mantidos, a sua sensibilidade apurada para double-stranded (ds) RNA de interferência mediada (RNAi), e sua docilidade para microscopia de fluorescência como ao vivo ou fixo células.

Células S2 podem ser cultivadas em uma variedade de meios, incluindo uma série de baixo custo, disponíveis comercialmente, totalmente definido, sem soro media ^2. Além disso, eles crescem de forma otimizada e rapidamente a 21-24 ° C e podem ser cultivadas em uma variedade de recipientes. Ao contrário das células de mamíferos, as células S2 não necessitam de um ambiente regulado, mas sim fazer o bem com o ar normal e pode até mesmo ser mantido em frascos lacrados.

Complementando a facilidade de RNAi em células S2 é a capacidade de analisar rapidamente fenótipos experimentalmente induzida por fase ou microscopia de fluorescência de células fixas ou ao vivo. Células S2 crescer em cultura como uma monocamada única, mas não exibem inibição por contato. Em vez disso, as células tendem a crescer em colônias nas culturas densas. Em baixa densidade, culturas S2 cultivadas em vidro ou plástico da cultura de tecidos tratados são redondos e fracamente ligados. No entanto, a citologia de células S2 pode ser muito melhorada, induzindo-os a se achatar extensivamente através da cultura brevemente as sobre uma superfície revestida com a lectina, concanavalina A (ConA) ^3. Células S2 também pode ser estavelmente transfectadas com marcadores fluorescentes marcadas para estruturas rótulo ou organelas de interesse em células vivas ou fixos. Portanto, o cenário habitual para a análise microscópica de células é esta: primeiro, as células S2 (que pode possuir para expressar transgenes marcadores marcados) são tratados por RNAi para eliminar uma proteína-alvo (s). RNAi tempo de tratamento pode ser ajustado para permitir que as diferenças em proteína turn-over cinética e para minimizar o trauma celular / morte, se a proteína-alvo é importante para a viabilidade. Em seguida, as células tratadas são transferidos para um prato contendo uma lamela pré-revestida com ConA para induzir as células a se espalhar e firmemente aderem ao vidro. Finalmente, as células são gravadas com a escolha do pesquisador de modos de microscopia. Células S2 são particularmente bons para estudos que necessitem de visualização alargado de células vivas uma vez que estas células se manter saudável à temperatura ambiente e atmosfera normal.

Protocolo

1. Preparar as células para microscopia S2

Schneider células S2 foram derivadas de embriões tripsinizados tardia de Oregon R Drosophila. Cultura original Schneider consistia em uma mistura de tipos de células, mas tornou-se mais homogênea com passagem contínua ^1. Eles foram descritos como sendo de macrófagos-like (são fagocíticas) com hemócitos-como a expressão do gene. Células S2 pode ser obtido a partir da ATCC, DGRC, ou Invitrogen.

A. Seleção de meio de crescimento

Um número de meios de comunicação têm sido utilizados para cultura de células S2. Nenhum dos meios d....

Discussão

Para o campo de biologia celular, um sistema ideal seria barato de manter, fácil de manipular, e passíveis de uma variedade de técnicas. Células Drosophila S2 satisfazer essas exigências, e assim eles tornaram-se rapidamente o sistema de escolha para um crescente número de celular laboratórios de biologia.

Nós apresentamos um breve resumo dos métodos para preparar células S2 para microscopia. Uma virtude notável de células S2 é o fato de que eles crescem bem em atmosfera normal e te.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Células S2	ATCC	CRL-1963	http://www.atcc.org/
Células S2	DGRC	número de estoque 6	https://dgrc.cgb.indiana.edu/
Células S2	Invitrogen	R690-07
Sf900 II	Invitrogen	10902-096	meio livre de soro
HyClone SFX-Insect	Thermo Fisher Scientific, Inc.	SH30278	meio livre de soro
Insect-Xpress	BioWhittaker	12-730	meio livre de soro
Meio Schneider’s S2	Invitrogen	11720-034	Adicione 10% (final) de FBS inativado pelo calor para obter o meio completo.
Soro bovino fetal	Invitrogen	10438026	inativado pelo calor
Solução antibiótica 100x	MP Biomedicals	91674049	contém penicilina (10000 U/mL), estreptomicina (10000 μg/mL) e anfotericina B (25 μg/mL)
Concanavalina A	MP Biomedicals	195283
Formaldeído	Electron Microscopy Sciences	15714	solução a 32%
Metanol	Mallinckrodt Baker Inc.	9049	anidro, grau ACS
Peneiras moleculares	Acros Organics	19724	tipo 3A