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Este protocolo é um trecho de Sarasija e Norman, Medição das Taxas de Consumo de Oxigênio em Caenorhabditis elegans Intacto, J. Vis. Exp. (2019).
1. Crescimento e sincronização da população de nematóides
Esses animais atingirão o estágio larval L4 após ~42 h. Neste momento, mova as larvas L4 usando um picareta de platina para placas NGM semeadas OP50 contendo 0,5 mg / mL de 5-fluoro-2'-desoxiuridina (FUdR) para evitar que produzam progênie.
OBSERVAÇÃO Certifique-se de que, dentro de um experimento, todas as cepas sejam sincronizadas por um período de tempo semelhante. O tratamento FUdR esteriliza os animais e evita a postura de ovos e a produção de progênies, o que pode influenciar o OCR. Esses animais esterilizados serão analisados no dia seguinte (dia 1 de animais adultos a ~66 h) para o ensaio. Foi relatado que o FUdR afeta a fisiologia e a expectativa de vida de certos vermes mutantes. Portanto, isso deve ser levado em consideração quando o medicamento é usado para esterilização. Os vermes também podem ser esterilizados por meio de mutações feminizantes, como fem-1 (hc17) ou fem-3 (e2006). No entanto, essas mutações podem afetar a função mitocondrial.
- Transfira larvas L4 de origens genéticas desejadas (por exemplo, N2 [tipo selvagem] e animais sel-12) para placas de meios de crescimento de nematóides (NGM) (consulte a Tabela 1 para receita) recém-semeadas com um gramado de Escherichia coli (OP50). Use pelo menos duas placas de 100 mm ou três de 60 mm para cada cepa. Incube os vermes na temperatura de crescimento apropriada (entre 15–25 °C) por 3–4 dias ou até que as placas estejam concentradas com grande número de ovos e vermes grávidas.
- Lave os ovos e vermes das placas usando aproximadamente 6 mL de tampão M9 (consulte a Tabela 1 para receita) por placa de 100 mm de nematóides e transfira-os com pipetas Pasteur de vidro para tubos de centrífuga individuais de 15 mL para cada cepa. Gire esses tubos para baixo por 3 min a 6.180 x g e aspire o tampão M9, retendo apenas os animais e os ovos pellet.
- Adicione 3-4 mL de solução de alvejante (consulte a Tabela 1 para receita) a cada tubo e vórtice intermitentemente por 6 min. Adicione tampão M9 para encher cada tubo e gire a 6.180 x g por 1 min e aspire o sobrenadante. Repita esta lavagem com M9 três vezes e mova o pellet de ovo para um novo tubo de 15 mL contendo aproximadamente 9 mL de tampão M9.
- Sincronize os vermes recém-eclodidos nutando a 20 ° C por 16 a 48 h. Gire esses tubos a 6.180 x g por 1,5 min e coloque os animais L1 sincronizados em placas NGM individuais recém-semeadas com um gramado de OP50 (aproximadamente 6.000 a 10.000 animais por placa de 100 mm) e mantenha a 20 ° C.