Remoção de insetos puparium: um método para investigação de pupas

Resumo

Fonte: Fukutomi, Y., et al. Métodos para estadiamento de períodos de pupa e medição da pigmentação da asa de Drosophila guttifera.J. Vis. Exp. (2018).

Este artigo descreve uma técnica para remover o pupário de um inseto, mantendo a pupa interna intacta e, portanto, adequada para uma investigação mais aprofundada. O protocolo de exemplo mostra o procedimento com Drosophila guttifera; no entanto, esta técnica é aplicável a outras espécies de Drosophila.

Protocolo

Este protocolo é um trecho de Fukutomi et al., Métodos para estadiamento de períodos de pupa e medição da pigmentação da asa de Drosophila guttifera, J. Vis. Exp. (2018).

1. Removendo pupário

NOTA As pupas de Drosophila são cobertas por uma estrutura chamada pupário. Um inseto de Muscomorpha (moscas) não perde sua cutícula larval na pupação; em vez disso, endurece a cutícula após a apólise e a usa como uma capa protetora da pupa, o pupário. Uma pupa que reside dentro de um pupário tem uma cutícula pupal verdadeira, que é muito macia e frágil. Antes que a apólise ocorra em torno de P4 (ii), o epitélio e o pupário estão ligados juntos e, portanto, remover o pupário sem danos é muito difícil. Após P5, a remoção do pupário é trabalhosa, mas útil para observação morfológica e definição dos estágios de pupa. O processo é realizado da seguinte forma.

1. Fixe um pedaço de fita dupla-face em um pedaço de papel toalha.
2. Coloque uma pupa na fita dupla face com o lado ventral para cima (Figura 1A).
3. Localize o espaço entre o lado anterior do pupário e a pupa interna. Segure e remova o pupário ao redor dessa lacuna usando uma pinça e exponha o lado anterior da cabeça da pupa.
4. Insira a ponta de uma pinça movendo-a paralelamente ao eixo ântero-posterior. Levante a ponta da pinça para quebrar localmente o pupário. Repita esta ação até que a quebra atinja a parte posterior do pupário. Certifique-se de que também seja formada uma lacuna entre o pupário e as pernas da pupa e quebre o lado ventral do pupário e minimize os danos à pupa interna (Figura 1B).
5. Depois de quebrar o pupário o máximo possível, retire a pupa usando um pincel fino (# 5/0) (Figura 1C).
6. Coloque a pupa sobre um pedaço de papel de seda umedecido com ddH₂O e colocado em uma placa de Petri de plástico (diâmetro 60 mm x altura 15 mm). Tire fotos o mais rápido possível, pois a pupa exposta é vulnerável e fica seca facilmente.
    

Resultados

Figura 1. Ilustração da remoção do pupário.(A) Coloque uma pupa com o lado ventral voltado para cima em um pedaço de fita dupla-face. Remova a parte anterior do pupário. (B) Quebre o pupário com uma pinça do lado ventral. (C) Depois de quebrar o pupário, retire o pupa usando um pincel.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Drosophila guttifera	O Centro de Estoque de Espécies de Drosophila na UC San Diego	15130-1971.10	Drosophila guttifera, uma espécie de mosca da fruta usada neste artigo
Fita dupla face NICETACK	Nichiban	NW-15SF	Fita dupla face, para remover pupário
Fórceps Dumont #5	Ferramentas de Belas Ciências	11252-20	Fórceps, para remover pupário
Pincel Van Gogh VISUAL	Talens Japão	GWVR-#5/0	Pincel para remover pupário
Estereomicroscópio	Olimpo	SZX16	Estereomicroscópio, para observação morfológica
Câmera digital	Olimpo	DSE-330-A	Câmera digital, para imagem
Placa de cultura de tecidos padrão Falcon	Corning	353002	Placa de Petri de plástico (diâmetro 60 mm x altura 15 mm)