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Parte 1: Isolamento de tRNA cobrados total de
- Células sedimento em uma centrífuga de mesa em 2000 RFC por 5 minutos. O equivalente a 1 600 OD de células deve produzir pelo menos 1μg de RNA total e um mínimo de 30 mg é recomendado para o procedimento.
- Ressuspender as células em solução tampão de lise constituído por 0,3 M tampão acetato de Na + (pH 4,5) e 10 mM EDTA. Vortex com igual volume de acetato de Na +-saturada de fenol / clorofórmio (pH 4,5) três vezes para cada 30 s. Certifique-se sempre manter as amostras em gelo entre vórtex. Acetato de tampão pode ser preparada a partir de NaOAC e HOAc enquanto saturada de acetato de fenol / clorofórmio pode ser preparado pela mistura de 1 parte 5 M tampão acetato (pH 4,5) com 9 partes de fenol / clorofórmio.
Nota: o isolamento do RNA total é realizada sob condições levemente ácidas e no gelo para evitar deacylation de tRNA carregado. - Centrifugar a 18.600 RFC por 15 minutos a 4 ° C. Remover a camada aquosa e executar a nova extracção de acetato saturada de fenol / clorofórmio.
- Após a segunda extração precipitar o RNA, adicionando volumes de etanol e 2,7 x centrifugação a 18.600 RFC por 30 minutos a 4 ° C.
- Pellets ressuspender RNA em solução tampão de lise e precipitado com etanol pela segunda vez.
- Finalmente, ressuspender o RNA em uma solução contendo 10 mM de acetato tamponado (pH 4,5) e 1 mM EDTA para posterior tratamento. A amostra pode ser armazenada de maneira estável a -80 ° C por cerca de duas semanas. Prolongar o armazenamento não é recomendado como alguns tRNA carregado vai começar a deacylate.
Parte 2: Elaboração de Normas de tRNA
- Calor E. padrões coli tRNA em 10,5 M a 85 ° C em 45 mM Tris-Cl pH 7,5 por 2 minutos. Pegue o tubo e deixe em temperatura ambiente por 3 minutos.
- Adicionar MgCl 2 a uma concentração final de 20 mM e incubar a 37 ° C por 5 minutos.
- Adicione a mistura de reacção sintetase para a reação final contém 5 mM tRNA, 60 mM Tris-HCl (pH 7,5), 12,5 mM MgCl 2, 10 mM KCl, 3 mM ditiotreitol, 1,5 mM ATP, 1 mM espermina, 1 mM dos respectivos aminoácido, e 4,2 unidades / mL E. coli mix sintetase aminoacil-tRNA. Incubar a 37 ° C por 15 minutos.
- Adicionar um volume igual de 0,5 M de acetato tampão (pH 4.5) e extrair com acetato saturada de fenol / CHCl 3 em pH 4.5.
- Precipitar os padrões tRNA com volumes de etanol e 2,7 x centrifugação a 18.600 RFC por 30 minutos a 4 ° C.
- Ressuspender as normas em 50 mM tampão acetato (pH 4,5) com 1 mM EDTA e armazenar a -80 ° C por até um mês.
Parte 3: Cy3/Cy5 rotulagem de tRNA
- Para a amostra tRNA cobrado incubar RNA total a uma concentração de 0,1 g / mL com 0,066 mM cada E. coli tRNA padrões (ie pmole 0,67 mg por cada padrão de RNA total) e 100 mM de acetato tamponado (pH 4,5) na presença de 50 mM NaIO4 por 30 minutos em temperatura ambiente. Para controlar o uso total da amostra tRNA 50 mM NaCl no lugar de NaIO4. Lembre-se de diluir o RNA apenas com soluções tamponadas para preservar a carregar.
- Para matar a reação de glicose para adicionar 100 mM e incubar à temperatura ambiente por 5 minutos.
- , A fim de remover qualquer NaIO4 restante da amostra realizar uma troca de buffer usando uma coluna de spin G25. Para melhores resultados equilibrar a primeira coluna, executando 200 mM tampão acetato tamponado (pH 4,5) por ele antes de aplicar a sua amostra.
- Precipitar a amostra pela adição de acetato tamponado (pH 4,5) para uma concentração final de 133 mM e NaCl para uma concentração final de 66 mM e 2,7 x volumes de etanol. Ocasionalmente, uma segunda precipitação podem ser necessários para as amostras oxidadas. Isso é necessário somente se o pellet parece significativamente diferente do pellet controle da mesma amostra. Por exemplo, um pellet significativamente maior ou mais difusa. Se uma precipitação etanol de segunda é necessária ressuspender pellet em 50 mM de acetato pH 4,5 e 200 mM NaCl antes da adição de etanol.
- Para as amostras deacylation tRNA são suspensas em 50 mM Tris-HCl (pH 9) e incubados a 37 ° C por 30 min. A reação é neutralizado pela adição de igual volume de acetato 50 mM tampão (pH 4,5) e 100 mM NaCl. Precipitado com 2,7 x volumes de etanol. Após precipitação, o RNA é ressuspenso em água a ~ 1 mg / mL. Tanto o controle e as amostras oxidadas devem ser executados em gel de agarose para verificar a qualidade RNA.
- Para anexar etiquetas fluorescentes oligo para o tRNA 0,1 mcg / mL de RNA deacylated é incubada em 1x tampão ligase, DMSO 15%, 4 mM Cy3 ou Cy5 contendo oligonucleotides, 0,5 unidades / mL DNA ligase T4, e leveduras exo-fosfatase (5.000 unidades / mL) a 16 ° C durante a noite (mais de 16 h). O exo-fosfatase é necessário apenas para as amostras obtidas a partir de leveduras e pode ser omitted se esse protocolo é utilizado para E. coli ou amostras humanas.
- Após ligadura amostras são misturadas com 4 volumes de 50 mM KOAc (pH 7), 200 mM KCl, e então extraído com um volume igual de clorofórmio fenol /. Após a extracção da fase aquosa, os preparativos estão RNA precipitado com etanol e ressuspenso em água a cerca de 0,1 mcg / mL.
- Ligadura eficiência pode ser avaliada através da execução de 5-10% das amostras em gel de poliacrilamida 12% contendo uréia 7M e visualizado com um scanner gel fluorescente. Esta análise PAGE também é útil para determinar a quantidade de oxidado e amostras de controlo necessários para a hibridização microarray. Um resultado bom ligadura deve mostrar ~ 10% ou mais do oligonucleotídeo Cy3/Cy5 contendo sendo ligada ao tRNA. Para amostras com eficiência rotulagem bom, 0,1-0,5 mg RNA total por amostra é utilizada para a hibridização matriz.
Parte 4: Hibridação e Análise do Microarray
- Antes de slides microarray de hibridização são fervidas em água destilada por 1-2 minutos para remover oligonucleotides desacoplado.
- Cy3/Cy5 amostras rotuladas são combinados com 140 mL de tampão de hibridação e DNA de esperma de salmão para uma concentração final de 140 mg / ml e poli (A) para uma concentração final de 70 mcg / ml.
- Um programa de hibridação, (tabela 1), é executado em uma variedade hybridizer automática. TRNA para o trabalho, é altamente recomendável que uma máquina automática de hibridização ser usado desde a hibridização produz manual de fundo de alta.
- Depois que o programa está completo manualmente lavar as lâminas com solução de Lavar 3 pelo menos duas vezes agitando em um tubo de 50 ml por 3-5 minutos.
- Slides pode ser secas por centrifugação a baixa velocidade, a menos de 200 RFC, por 5-10 minutos. É importante manter o desliza para fora da luz desde a exposição à luz alvejarão o fluoróforos.
- Após as lâminas são secas que devem ser verificados imediatamente para melhores resultados, se necessário, eles podem ser salvos por vários dias em um lugar seco e escuro à temperatura ambiente. Slides podem ser digitalizados 2-3 vezes sem degradação perceptível na qualidade da imagem.
Parte 5: Resultados Representante
Quando isolados adequadamente a amostra de RNA total, deve produzir um espectro muito limpo, com uma 260 OD: OD relação de perto de 2 280. Não deve haver nenhuma proteína ou contaminação detectável fenol. Quando executado em gel agarose 1%, uma banda tRNA forte deve ser observado com outros possíveis bandas de ácido nucléico variando entre organismos. Após a oxidação de uma banda tRNA limpas devem ser observados. Se uma amostra é visivelmente mais fraco do que outras amostras ou manchas é observada, as amostras não devem ser usadas para microarrays. Microarrays devem ter fundo muito baixa, que é uma ordem de magnitude menor do que a sonda mais fraco tRNA. Elevado ruído de fundo é geralmente devido a problemas durante as etapas de lavagem. Isto normalmente pode ser corrigido através da preparação de soluções de lavagem fresca e lavar bem todos os equipamentos e tubulação para remover SDS residual e precipitado.
| Passo | Detalhes |
| O-ring condicionado | 75 ° C, 2 min |
| Apresentar amostra | 60 ° C |
| Exemplo de desnaturar | 90 ° C, 5 min |
| Hibridização | 60 ° C, 16h |
| Lavar uma | 50 ° C, 10s fluxo segurar 20s |
| Lavar 2 | 42 ° C, 10s fluxo segurar 20s |
| Lavar 3 | 42 ° C, 10s fluxo segurar 20s |
Tabela 1: Protocolo de hibridação