Este protocolo é um trecho de Qiang et al., Um ensaio de escavação/tunelamento para detecção de hipóxia em larvas de Drosophila melanogaster, J. Vis. Exp. (2018).
1. Preparação de larvas
- Dois ou mais dias antes de iniciar o ensaio, estabelecer cruzamentos das combinações experimentais e de controle desejadas (mínimo de 20 fêmeas e 10 machos cada) em placas de postura de ovos, conforme descrito por Wieschaus e Nusslein-Volhard, mas usando béqueres de polipropileno de 50 mL e placas de Petri descartáveis de 6,0 cm contendo ágar uva e untadas com pasta de fermento antes do uso. Mantenha as moscas em pratos de postura de ovos na escuridão em temperatura ambiente até que sejam necessárias.
- Receita de ágar uva – combine 100 mL de concentrado de suco de uva 100% congelado, 350 mL de água desioinizada, 5 mL de ágar glacial acético e 13 g de ágar D. melanogaster em um copo de vidro de 1L. Microondas em rajadas de 1-2 min, mexendo entre as rajadas, até que o ágar esteja todo dissolvido. Resfrie a solução por alguns minutos e adicione 10 mL de Nipagen a 10% (p / v) de Nipagen (metil-p-hidroxibenzoato) em etanol a 95%. Misture e pipete 7 mL por placa em placas de Petri descartáveis de 6,0 cm, deixe gelificar e secar em temperatura ambiente por 3-4 h. Conservar a 4 °C em sacos de plástico.
- Receita de pasta de fermento – 7 g de fermento seco, 10 mL de água deionizada, misture com uma espátula até obter uma consistência uniforme.
- Coletas de ovos cronometradas para gerar larvas experimentais e de controle. Usando pratos de uva novos e manchados de fermento, colete os ovos em temperatura ambiente por 4 h na escuridão durante as primeiras horas da manhã. Remova essas placas de coleta de 4 h e substitua por placas novas. Incubar as placas de recolha de 4 h durante a noite a 25 °C até à tarde do dia seguinte, altura em que a maior parte das larvas terá eclodido. Colete essas larvas de primeiro ínstar e use-as para configurar o experimento.
2. Configurando placas de ensaio
- Preparação de placas de ensaio. Para uma única execução do ensaio, prepare cinco placas de ensaio cada uma com 10 larvas experimentais e cinco placas com 10 larvas de controle. Use uma broca de cortiça de 1,5 cm para remover um núcleo central de ágar de cada prato, criando um orifício para os alimentos. Coloque a pasta de fermento (0,8 - 0,9 g) no buraco e bata suavemente com uma espátula para fazer um monte preenchendo o buraco.
- Preparação da placa de ágar – combine 700 mL de água deionizada com 16 g de ágar D. melanogaster em um copo de vidro de 2L e leve ao microondas por 5 min. Retire do micro-ondas e mexa com uma haste de vidro para trazer o ágar não dissolvido para a solução. Adicione 17,5 mL de Nipagen a 10% (p / v) em etanol a 95%, misture e continue o aquecimento por microondas em rajadas de 30 s, seguidas de agitação, até que todo o ágar esteja completamente dissolvido. Deixe esfriar por um ou dois minutos e, em seguida, pipetar alíquotas de 15 mL em placas de Petri de plástico de 10 cm. Deixe o ágar gelificar, cubra os pratos com tampas e deixe-os secar em temperatura ambiente por algumas horas ou durante a noite. Armazene os pratos em sacos plásticos lacrados a 18 °C.
NOTA 1: Para evitar a formação de cristais de Nipagen na superfície das placas devido ao excesso de dessecação, use placas dentro de alguns dias após a preparação. Se necessário, os cristais podem ser dissolvidos novamente colocando alguns microlitros de álcool a 95% sobre eles.
NOTA 2: lotes de ágar podem ter diferentes propriedades de gelificação. As placas de gel seco devem ser firmes ao toque e suficientemente resistentes para que um círculo de ágar limpo e intacto possa ser removido ao usar a broca de cortiça para criar o orifício de comida (veja acima).
- Instalação de larvas em placas de ensaio. Use pressão mecânica para curvar a ponta de uma microespátula de plástico e mergulhe a ponta em pasta de fermento para fornecer "adesivo" para pegar larvas. Pegue as larvas do primeiro ínstar individualmente e coloque-as no prato de ágar próximo ao monte de comida. Preparar pelo menos cinco placas replicadas de 10 larvas para genótipos experimentais e de controlo. Depois de concluído, tampe e rotule cada placa e coloque as placas (com a tampa para cima) em um espaço escuro à temperatura ambiente (em nosso laboratório, isso é 22 ° C).
3. Placas de ensaio de monitoramento
- Examine as placas diariamente sob um microscópio de dissecação e registre o número de larvas em cima do alimento ou na superfície do ágar. Observe quaisquer larvas mortas ou moribundas visíveis. Observe quando, e se, o tunelamento no substrato do ágar é visto à medida que as larvas se movem para o terceiro ínstar. Anote as datas em que as pupas começam a se formar e observe quaisquer anormalidades nas pupas. Continue as observações diárias até que todas as larvas tenham morrido ou pupado.
- Remova as pupas cuidadosamente do prato com uma agulha dobrada e transfira para um prato de uva. Se desejar, continue monitorando as pupas para determinar quantas eclose quando adultas.
