Drosophila Ensayo de madriguera y tunelización: un método para evaluar la hipoxia tisular en larvas de mosca

Overview

Este video muestra un método para probar la hipoxia en larvas de Drosophila mediante la evaluación de sus habilidades de madriguera y tunelización. Usando esta técnica los investigadores pueden distinguir las larvas que experimentan privación de oxígeno de aquellos con déficits de desarrollo. El protocolo de ejemplo muestra la configuración de este ensayo.

Protocol

Este protocolo es un extracto de Qiang et al., A Burrowing/Tunneling Assay for Detection of Hypoxia in Drosophila melanogaster Larvae, J. Vis. Exp. (2018).

1. Preparación de larvas

1. Dos o más días antes de comenzar el ensayo, establecer cruces de las combinaciones experimentales y de control deseadas (mínimo 20 hembras y 10 machos cada una) en platos de lay de huevo como lo describen Wieschaus y Nusslein-Volhard pero utilizando vasos de polipropileno de 50 ml y platos petri desechables de 6,0 cm que contienen agar de uva y se unta con pasta de levadura justo antes de su uso. Mantenga las moscas en los platos de huevo en la oscuridad a temperatura ambiente hasta que sea necesario.
2. Receta de agar de uva – combine 100 ml congelados 100% concentrado de jugo de uva, 350 ml de agua desioinizada, 5 ml de acético glacial y 13 g de agar D. melanogaster en un vaso de vidrio 1L. Microondas en ráfagas de 1-2 minutos, revolviendo entre ráfagas, hasta que el agar se disuelva. Enfríe la solución durante unos minutos y luego agregue 10 ml de 10% (w/v) de Nipagen (metil-p-hidroxybenzoato) en 95% etanol. Mezcle, luego pipetee 7 ml por plato en platos desechables de 6,0 cm de Petri, deje gelificar y secar a temperatura ambiente durante 3-4 h. Conservar a 4 °C en bolsas de plástico.
3. Receta de pasta de levadura – 7 g de levadura seca, 10 ml de agua desionizada, mezclar con una espátula hasta una consistencia uniforme.
4. Colecciones de huevos cronometrados para generar larvas experimentales y de control. Con platos de uva nuevos y manchados de levadura, recoger huevos a temperatura ambiente durante 4 h en la oscuridad durante las horas de la mañana. Retire estas placas de recogida de 4 h y sustitúyalas por platos frescos. Incubar las placas de recogida de 4 h durante la noche a 25 °C hasta la tarde del día siguiente, cuando la mayoría de las larvas habrán eclosionado. Recoge estas primeras larvas instar y úsalos para configurar el experimento.

2. Configuración de placas de ensayo

1. Preparación de placas de ensayo. Para una sola ejecución del ensayo, prepare cinco placas de ensayo cada una de 10 larvas experimentales y cinco placas de 10 larvas de control. Utilice un bómero de corcho de 1,5 cm para eliminar un núcleo central de agar de cada plato creando un agujero para el alimento. Ponga la pasta de levadura (0.8 - 0.9 g) en el agujero y palmada suavemente con una espátula para hacer un montículo llenando el agujero.
2. Preparación de la placa de agar – combine 700 ml de agua desionizada con 16 g de agar D. melanogaster en un vaso de vidrio de 2L y microondas durante 5 minutos. Retire del microondas y revuelva con una varilla de vidrio para llevar un agar sin disuelto a la solución. Añadir 17,5 ml de 10% (w/v) Nipagen en 95% etanol, mezclar, luego continuar el calentamiento de microondas en ráfagas de 30 s seguido de agitación, hasta que todo el agar se disuelva por completo. Enfriar durante uno o dos minutos, luego pipetear 15 mL aliquots en platos petri de plástico de 10 cm. Deje que el agar se gelifica, cubra los platos con tapas y déjelos secar a temperatura ambiente durante unas horas o durante la noche. Guarde las placas en bolsas de plástico selladas a 18 °C.
   NOTA 1: Para evitar la formación de cristales de Nipagen en la superficie de las placas debido al exceso de desecación, utilice placas a los pocos días de la preparación. Si es necesario, los cristales se pueden re-disolver dejando caer unos microlitros de 95% de alcohol sobre ellos.
   NOTA 2: los lotes de agar pueden tener diferentes propiedades de gelling. Las placas de gel seco deben ser firmes al tacto y lo suficientemente resistentes como para que se pueda eliminar un círculo limpio e intacto de agar cuando se utiliza el bómero de corcho para crear el agujero de comida (ver arriba).
3. Colocación de larvas en placas de ensayo. Utilice la presión mecánica para curvar la punta de una microsparácula de plástico y sumergir la punta en pasta de levadura para proporcionar "adhesivo" para recoger larvas. Recoge las primeras larvas instar individualmente y colócalos en el plato del agar cerca del montículo de alimentos. Preparar al menos cinco placas de réplica de 10 larvas para genotipos experimentales y de control. Una vez completada, tapa y etiqueta cada placa y coloca las placas (lado de la tapa hacia arriba) en un espacio oscuro a temperatura ambiente (en nuestro laboratorio esto es 22 °C).

3. Monitoreo de placas de ensayo

1. Examine las placas diariamente bajo un microscopio diseccionador y registre el número de larvas en la parte superior de los alimentos o en la superficie del agar. Tenga en cuenta las larvas muertas o moribundas visibles. Tenga en cuenta cuándo, y si, el túnel en el sustrato del agar se ve como larvas se mueven en tercera estrella. Tenga en cuenta las fechas en las que las pupas comienzan a formarse y notar cualquier anomalía pupal. Continúe las observaciones diarias hasta que todas las larvas hayan muerto o se hayan cachorro.
2. Retire las pupas cuidadosamente del plato con una aguja de burla doblada y transfiérala a un plato de uva. Si lo desea, continúe monitoreando pupas para determinar cuántas eclosa como adultos.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
Dehydrated yeast
Frozen grape juice concentrate	Welch's		Available at most large supermarkets
Glacial acetic acid	Sigma-Aldrich	320099
Drosophila agar	Apex Bioresearch Products	66-103
Methyl-para-hydroxybenzoate	Apex Bioresearch Products	20-658
EQUIPMENT
50 ml polypropylene beakers
6.0 cm disposable Petri dishes	Falcon	08757100B
10 cm disposable plastic Petri dishes	E+K Scientific	EK-24104
Plastic microspatulas	Corning Incorporated	3012
Bent teasing needle	Nasco	S08848MH
Dissecting microscope			Any microscope with 10-30X magnification