drosófila Dissecção de disco imaginal de larvas: um método para observar o desenvolvimento de epitélios

Resumo

Fonte: Morimoto, K. e Tamori, Y. Indução e Diagnóstico de Tumores no Epitélio do Disco Imaginal de Drosophila. J. Vis. Exp. (2017).

Ao corar discos imaginais de Drosophila, muitas vezes é realizada uma dissecção grosseira onde os discos são expostos, mas permanecem presos ao corpo. Uma vez corados, os discos de interesse são isolados e montados. O protocolo de exemplo demonstra um procedimento para dissecção e montagem do disco imaginal da asa.

Protocolo

Este protocolo é um trecho de Morimoto e Tamori, Indução e Diagnóstico de Tumores em Drosophila Imaginal Disc Epithelia, J. Vis. Exp. (2017).

1. Dissecção de larvas

1. Colete larvas de terceiro ínstar errantes com uma vara de madeira ou pinça romba, genotipe-as por marcadores fluorescentes apropriados (por exemplo, EGFP) sob um microscópio estereoscópico de fluorescência e coloque-as em uma placa de dissecação com PBS (solução salina tamponada com fosfato).
2. Lave as larvas em PBS pipetando com pipetas de transferência de plástico de 2 mL.
3. Aperte o centro da larva com uma pinça e rasgue o corpo ao meio com a outra pinça.
4. Aperte o gancho da boca da metade anterior com uma pinça e empurre a boca em direção ao corpo com a outra pinça para virar o corpo do avesso.
5. Remova materiais desnecessários, como glândulas salivares ou corpos adiposos, com uma pinça.

2. Fixação e coloração de anticorpos

1. Transfira a metade anterior dissecada do corpo larval (incluindo discos de asas imaginárias) para um tubo plástico de 1,5 mL e fixe em 1 mL de solução Fix (4% de formaldeído em PBS) por 10 min em temperatura ambiente no escuro com rotação suave.
   cuidado: O formaldeído é tóxico e tem potencial cancerígeno. Use luvas e roupas de proteção para evitar o contato com a pele.
   OBSERVAÇÃO: Nesta parte, todas as etapas ocorrem em um nutador em temperatura ambiente no escuro, salvo indicação em contrário.
2. Remova a solução Fix e descarte. Lave os tecidos com 1 mL de PBT (0,3% Triton X-100 em PBS) três vezes por 15 min cada.
3. Remova o PBT e adicione 1 mL de PBTG (0,2% de albumina de soro bovino e 5% de soro de cabra normal em PBT) para bloqueio e nutato 1 h em temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C.
4. Remover PBTG e adicionar solução de anticorpos primários adequadamente diluída com PBTG (ver Tabela de Materiais) e nutato durante a noite a 4 °C.
5. Remova a solução de anticorpo primário e lave os tecidos com 1 mL de PBT três vezes por 15 min cada.
6. Remover o PBT e adicionar uma solução de anticorpos secundários adequadamente diluída com PBTG (1:400). Nutato durante 2 h à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 °C.
7. Remova a solução de anticorpo secundário e lave os tecidos com 1 mL de PBT duas vezes por 15 min cada.
8. Para corar a F-actina, remova o PBT e adicione a solução de faloidina adequadamente diluída em PBS (1:40). Em seguida, nutate por 20 min. Remova a solução de faloidina e lave os tecidos com 1 mL de PBT duas vezes por 15 min cada.
9. Para contracorar o DNA nuclear, remova o PBT e adicione a solução de DAPI (4', 6-diamidino-2-fenilindo) (0,5 μg / mL de DAPI em PBS). Em seguida, nutate 10 min.
   cuidado: O DAPI tem potencial carcinogênico. Use luvas e roupas de proteção para evitar o contato com a pele.
10. Remova a solução de DAPI e lave os tecidos com 1 mL de PBT duas vezes por 15 min cada.
11. Enxágue uma vez em 1 mL de PBS por 10 min em temperatura ambiente.
12. Remover o PBS e adicionar 500 μL de glicerol a 100 % como meio de pré-montagem.

3. Montagem em lâminas de microscópio

1. Coloque os tecidos corados em uma lâmina de microscópio usando uma pipeta de transferência de plástico de 2 mL.
2. Transfira os tecidos para gotas de meio de montagem em outra lâmina de microscópio com fórceps.
3. Segure a extremidade do tecido dissecado com uma pinça e afaste os discos antenais do cérebro e dos olhos com a outra pinça.
   OBSERVAÇÃO: Mantenha os cérebros dissecados para colocá-los perto dos discos imaginários das asas. Os cérebros atuam como uma plataforma que impede que a lamínula esmague os discos imaginários das asas.
4. Para isolar os discos imaginários da asa, segure a extremidade do tecido dissecado com uma pinça e arranhe suavemente a parede do corpo e rasgue os discos com a outra pinça.
   OBSERVAÇÃO: Se for difícil encontrar discos imaginários de asas, descasque a traqueia do lado posterior para o anterior. Os discos imaginais das asas grudam na traqueia.
5. Cubra suavemente os discos imaginais com uma lamínula e sele com esmalte; armazene a 4 °C.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Reagentes
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)	Wako	162-19321
TritonX-100	Wako	168-11805
Formaldeído	Wako	Telefone: 064-00406
albumina de soro bovino	sigma	Rolamento A7906
soro de cabra normal	sigma	G6767
meio de montagem, Vectashield	Laboratórios de vetores	H-1000
DAPI	sigma	D9542
mouse-anti-Dlg 4F3	Banco de Hibridoma de Estudos do Desenvolvimento	4F3 anti-discos grandes, RRID:AB_528203	diluir em PBTG, 1:40
mouse-anti-MMP1	Banco de Hibridoma de Estudos do Desenvolvimento	3A6B4, RRID:AB_579780	3 misturado 1:1:1 e diluído em PBTG, 1:40
mouse-anti-MMP1	Banco de Hibridoma de Estudos do Desenvolvimento	3B8D12, RRID:AB_579781	3 misturado 1:1:1 e diluído em PBTG, 1:40
mouse-anti-MMP1	Banco de Hibridoma de Estudos do Desenvolvimento	5H7B11, RRID:AB_579779	3 misturado 1:1:1 e diluído em PBTG, 1:40
anti-atubulina para camundongos	Banco de Hibridoma de Estudos do Desenvolvimento	AA4.3, RRID:AB_579793	diluir em PBTG, 1:100
Alexa Fluor 546 Faloidina	Sondas moleculares	Rolamento A22283	diluir em PBS, 1:40
anticorpo IgG anti-rato de cabra, Alexa Fluor 546	Sondas moleculares	Rolamento A11030	diluído em PBTG, 1:400
Cepas de mosca
sd-gal4	Centro de Estoque de Drosophila de Bloomington	#8609	recombinado com UAS-EGFP
upd-Gal4	Centro de Estoque de Drosophila de Bloomington	#26796	recombinado com UAS-EGFP
UAS-lgl-RNAi	Centro de RNAi de Drosophila de Viena	#51247
UAS-scrib-RNAi	Centro de RNAi de Drosophila de Viena	#105412
UAS-RasV12	Centro de Estoque de Drosophila de Bloomington	#64196
UAS-Yki3SA	Centro de Estoque de Drosophila de Bloomington	#28817
hsFLP	Centro de Estoque de Drosophila de Bloomington	#6
Act>CD2>GAL4 (flip-out GAL4)	Centro de Estoque de Drosophila de Bloomington	#4780	recombinado com UAS-EGFP
UAS-EGFP	Centro de Estoque de Drosophila de Bloomington	#5428	Cromossomo X
UAS-EGFP	Centro de Estoque de Drosophila de Bloomington	#6658	terceiro cromossomo
UAS-Dicer2	Centro de Estoque de Drosophila de Bloomington	#24650	segundo cromossomo
UAS-Dicer2	Centro de Estoque de Drosophila de Bloomington	#24651	terceiro cromossomo
vkg-GFP	Morin et al. 2001		Armadilha de proteína GFP