Este protocolo é um trecho de Immarigeon et al., Um protocolo baseado em FACS para isolar RNA das células secundárias das glândulas acessórias masculinas de Drosophila, J. Vis. Exp. (2019).
1. Soluções e Preparação de Materiais
- Prepare as seguintes soluções.
- Prepare o meio suplementado com soro (SSM): O meio de Drosophila de Schneider complementado com 10% de soro fetal bovino inativado pelo calor e 1% de penicilina-estreptomicina.
- Prepare alíquotas de 1x enzima tripsina (por exemplo, enzima TrypLE Express) e armazene em temperatura ambiente.
- Preparar alíquotas de papaína [50 U/ml] (conservadas a -20 °C e descongeladas apenas uma vez).
- Prepare 1x tampão fosfato salino (PBS, armazenado em temperatura ambiente).
- Prepare várias pontas de pipeta arredondadas por chama para a dissociação física das glândulas acessórias.
OBSERVAÇÃO: Use pontas de baixa retenção para manusear as glândulas acessórias, pois elas tendem a aderir ao plástico não tratado. O processo de arredondamento de chama reduz a abertura da ponta e suaviza as bordas da ponta. Isso garante uma dissociação eficiente após a digestão da peptidase sem cisalhar as membranas celulares.
- Corte uma ponta de 200 μL com uma lâmina afiada e passe-a suavemente sobre uma chama para arredondar sua ponta de modo que a abertura seja mais larga, mas suave para manuseio durante a etapa 2.7.
- Estreite a abertura de várias pontas de 1.000 μL passando a abertura da ponta perto de uma chama por menos de um segundo. Gire a ponta levemente para evitar derretimento excessivo ou entupimento. Classifique as pontas feitas do mais estreito para o mais largo. Isso pode ser feito cronometrando a velocidade de aspiração. Tente dissociar uma amostra em pequena escala de AGs para testar a eficiência das pontas mais estreitas.
OBSERVAÇÃO: Essas pontas são críticas para a agitação mecânica. As pontas de pipeta arredondadas por chama de qualidade permitem a dissociação completa, preservando a viabilidade celular. Como tal, essas pontas são bem lavadas com água no final do procedimento de reutilização. Isso permite a dissociação reproduzível do dia a dia.
2. Dissecção de glândulas acessórias
- Coloque 20 a 25 Drosophila machos em um prato de vidro com gelo.
- Dissecar 1 macho no SSM. Retire seu trato reprodutivo e limpe o par de glândulas acessórias de todos os outros tecidos, exceto o ducto ejaculatório.
OBSERVAÇÃO: Remova os testículos porque o esperma liberado pode criar aglomerados e perturbar o processo de dissociação. Remova o bulbo ejaculatório, o que dificulta o manuseio quando ele flutua.
- Com uma pinça, transfira as glândulas acessórias para uma placa de vidro preenchida com SSM à temperatura ambiente. Repita as etapas 2.2-2.3 20 vezes para obter um lote de 20 pares de glândulas em SSM.
OBSERVAÇÃO: Essas etapas serão alcançadas em 15 a 20 minutos. Os AGs devem parecer saudáveis e os movimentos peristálticos da camada muscular ao redor das glândulas devem ser visíveis. A GFP pode ser monitorada usando um microscópio fluorescente.
- Transfira as glândulas acessórias para 1x PBS para uma lavagem de 1-2 min em temperatura ambiente.
OBSERVAÇÃO: Para uma melhor dissociação, é imperativo enxaguar as glândulas com PBS. A duração desta etapa, no entanto, deve ser limitada, pois as células mostram sinais de estresse no PBS; células secundárias dissociadas em PBS incham e morrem rapidamente.
- Dilua 20 μL de papaína [50 U/mL] em 180 μL de enzima tripsina 1x para obter a solução de dissociação (para aumentar ou diminuir a escala, mantenha 9 μL de enzima tripsina e 1 μL de papaína para cada homem). Com uma pinça, transfira as glândulas acessórias para esta solução.
- Isole a ponta das glândulas acessórias (contendo células secundárias) da parte proximal. Use uma pinça fina para beliscar firmemente o meio de um lobo glandular e corte com a ponta afiada de uma segunda pinça. Remova a parte proximal das glândulas acessórias e o ducto ejaculatório para melhorar a dissociação e reduzir o tempo de classificação celular.
OBSERVAÇÃO: A dissecação da parte distal de 20 pares de glândulas levará de 15 a 20 minutos e a digestão por peptidases começará à temperatura ambiente.
- Depois que todas as pontas das glândulas tiverem sido dissecadas, transfira-as para um tubo de 1,5 mL usando uma ponta de pipeta especial de 200 μL preparada na Etapa 1.2.1. Deve ser largo, arredondado e úmido antes do manuseio das glândulas.
OBSERVAÇÃO: Para pipetar o tecido da glândula acessória, as pontas devem ser sempre pré-umedecidas com solução apropriada (enzima tripsina ou SSM, mantenha um tubo de cada para esse fim). Enxágue cuidadosamente as pontas entre as amostras para evitar contaminação.