Drosophila melanogaster Dissecção do ovário: uma técnica para preparação de tecido ex vivo

Neste artigo

Resumo

Fonte: Parker, D. J., et al. Estudando a estrutura e função mitocondrial em ovários de Drosophila. J. Vis. Exp. (2017).

Este vídeo descreve a anatomia geral do ovário de Drosophila e apresenta um método de dissecar ovários para imagens ao vivo ou fixas.

Protocolo

Este protocolo é um trecho de Parker et al., Estudando a estrutura e função mitocondrial em ovários de Drosophila, J. Vis. Exp. (2017).

1. Preparação de Drosophila (as ferramentas necessárias são representadas em Figura 1A)

Para qualquer um dos experimentos descritos, colete Drosophila (mantida em temperatura ambiente, ou 25 ° C) dentro de 5 dias após a eclosão e coloque-os em um frasco cheio de 5 a 7 mL de alimento para Drosophila (ver Tabela de Materiais), com não mais de 25 moscas em cada frasco; mantenha uma proporção fêmea: macho de 2: 1.
Polvilhe uma pequena quantidade de fermento granulado para estimular a produção de ovos de Drosophila. Realize a manipulação experimental dentro de 2 a 4 dias.

2. Dissecção de ovários de Drosophila (as ferramentas necessárias são representadas em Figura 1A)

Aqueça o meio de dissecação de insetos (consulte a Tabela de Materiais) à temperatura ambiente, 25 ° C. Encha três poços de uma placa de dissecação de vidro de oito poços, com 200 μL de meio em cada poço.
Anestesie Drosophila com CO₂ colocando a agulha da pistola de ar sob o tampão do frasco. Coloque-os em uma almofada de mosca. Usando um microscópio de dissecação, separe 5 fêmeas e coloque-as no primeiro poço do prato de dissecação. Manuseie uma Drosophila de cada vez ao realizar microscopia ao vivo.
Enquanto olha pela ocular do microscópio de dissecação, corte o tórax do abdômen usando dois pares de pinças. Usando a pinça, transfira cuidadosamente o abdômen para o segundo poço do prato.
Use um par de pinças para segurar o abdômen na extremidade posterior e empurre lentamente os ovários para fora (junto com o outro conteúdo abdominal) com o outro par de pinças. Se essa tentativa falhar, remova cuidadosamente o exoesqueleto abdominal inserindo a pinça na extremidade anterior para liberar os ovários.
Usando a pinça, segure um ovário individual pela extremidade posterior opaca (ou seja, os óvulos em estágio avançado cheios de gema) e mova-o cuidadosamente para o terceiro poço do prato para provocar para processá-lo para microscopia ao vivo ou para fixação para realizar imunocoloração.
Provoque cuidadosamente a bainha protetora ao redor dos ovários, varrendo levemente uma agulha provocadora da extremidade posterior para a anterior de cada ovário, segurando-a pela extremidade posterior com um par de pinças.
OBSERVAÇÃO: Para minimizar os danos durante a provocação, dobre a ponta da agulha e amplie cada ovário aumentando a ampliação do microscópio (Figura 1A). A provocação deve ser eficaz o suficiente para quebrar a bainha, mas também deve ser feita com cuidado para preservar a integridade dos ovaríolos.

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Resultados

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Figura 1: Plano Experimental e Preparação. (A) Ferramentas usadas nos métodos descritos: A. Frasco para moscas; B. Meio de dissecação de insetos; C. Paraformaldeído; D. Escova de mosca; E. Prato de dissecação; F. Vidro de cobertura; G. Tubo de microfuga. H. Prato com fundo de vidro; I. Lâmina de vidro; J. Micropipeta de 1.000 μL; K. Micropipeta de 200 μL; L. 2,5 μL micropipeta; M. Agulha...