성인 비행에서 말피난 투굴 해부 : Osmo조절 및 배설 기관을 분리

Overview

이 문서에서는 여성 드로소필라 플라이의 전방 말피기안 튜블러(MT)와 로사노 외의 예제 프로토콜에 대해 설명합니다. (2017) MT가 관류 챔버에서 라이브 이미징을 위해 준비하는.

Protocol

이 프로토콜은 로사노와 로메로에서 발췌, Drosophila 멜라노가스터 말피난 투불 에피텔리아에서 세포 내 pH의 광학 정량화형은 형광 유전적 인코딩 pH 지표, J. Vis. Exp. (2017).

1. 폴리 L-리신 슬라이드 준비

1. 표준 75 x 25mm 슬라이드 의 상단에 소수성 PAP 펜으로 40 x 20mm 테두리를 그리고 RT에서 15 분 동안 건조하도록 따로 설정합니다.
2. 재고 0.01% 폴리-L-리신(PLL) 용액을 각 슬라이드에 전송하고 RT에서 1h로 따로 설정합니다.
3. 파이펫으로 초과 PLL을 제거합니다. 향후 사용을 위해 50mL 원내 유리병에 솔루션을 저장합니다. 4 °C에 보관하십시오.
4. 진공 선으로 남은 솔루션을 흡인합니다. 전체 슬라이드 표면에서 진공 선을 실행하여 슬라이드에 솔루션이 남아 있지 않도록 합니다.
5. 사용하기 전에 RT에서 1 시간 동안 슬라이드를 따로 놓습니다. 표준 슬라이드 책에 최대 1개월 동안 RT에 건조 슬라이드를 저장합니다.

2. 해부 접시와 유리 막대의 준비

1. RT의 35 x 10mm 폴리스티렌 페트리 접시에 탄성동기 베이스의 4.5mL에 엘라스토머 경화제 0.5mL를 추가하여 깊이 5mm를 생성합니다. 일회용 파이펫 팁과 섞으세요. RT에서 탄성 중합체가 O/N을 치료하도록 허용합니다.
   참고: 엘라스토머는 분명하고 거품이 없어야 합니다. 거품의 지우기는 붓기 후에 10 - 15 분 동안 진공 항아리에 엘라스토머 플레이트를 유지함으로써 촉진 될 수있다.
2. 5mm 직경의 유리 막대를 손 사이에 잡고 점등된 분젠 버너 위로 막대의 중심을 녹여 끝을 떼어놓습니다. 유리가 녹아 얇고(0.1mm) 및 테이퍼드샤프트(도 1)를생성합니다.
   참고: 생크의 45° 각도는 튜블러를 처리하는 데 종종 도움이 됩니다. 이것은 생크가 당길 때 한 손을 낮추어 얻을 수 있습니다 (그림 1참조).
3. 단일 날카스틸 면도날의 무딘 면으로 중간에 얇은 샤프트를 부러뜨린다. 해부 범위에서 막대의 얇은 끝을 검사하여 브레이크가 깨끗한지 확인합니다.

3. 성인 드로소필라 전방 말피기안 투덜스의 해부

1. 해부 접시를 수집하고 섹션 2에서 유리 막대를 뽑아, 섹션 1에서 PLL 코팅 슬라이드, 접착제 관류 잘 분배, 진공 그리스, 밀봉 필름의 4 x 2 "스트립, #5 미세 집게 2 쌍, 얼음 차가운 슈나이더의 매체와 RT iPBS의 40 mL 알리쿼트.
2. 밀봉 테이프에 진공 그리스를 퍼뜨리고 접착제 관류 웰 칸막이를 테이프에 눌러 바닥과 그리스로 코팅합니다. 접착제 관류 잘 분배 잘 분배를 벗겨 PLL 코팅 슬라이드 위에 그리스 측 아래로 놓습니다. 각 표본 우물을 소수성 그리스로 추적상태로 두도록 관류 웰 디바이더를 제거하십시오.
3. PLL 코팅 슬라이드에 기름으로 둘러싸인 RT iPBS 200 μL을 배치하고 스테레오스코프 아래에 슬라이드를 이동합니다.
4. UAS-pHerry/capaR-GAL4를 빈 플라이 바이알로 놓고 10분 동안 얼음 위에 마취하십시오.
   참고: CO_2와달리 이 마취 방법은 파리가 탈수되지 않도록 합니다.
5. 얼음차가운 슈나이더의 매체를 해부 접시에 붓고 미세한 집게를 사용하여 마취된 여성 플라이 한 개를 해부 된 스테레오스코프 아래 접시에 옮춥춥시다.
6. 포셉 세트로 흉부로 날아간 다음 다른 쪽을 사용하여 복부의 후방을 부드럽게 잡습니다. 짧고 의도적인 동작으로 집게를 사용하여 플라이의 후방을 엽니다. 힌드구트가 보이면, 회향끝을 잡고 반복적이고 짧은 예인선을 통해 힌드구트를 몸에서 끌어내어 기본 트라철에서 창자와 MT를 풀어주면 됩니다.
   참고: 전방 및 후방 MT는 요관을 통해 미드구트와 힌구트의 교차점을 만나는 곳에서 볼 수 있습니다. 무료인 첫 번째 MT는 뒷구를 둘러싸고 있는 후방 튜블러일 것입니다. 이러한 무시될 수있습니다(그림 2A).
7. 두 번째 MT 세트가 복부가 없는 후 미세한 집게로 우터에서 전방 MT를 꼬집습니다. 이렇게 하면 전방 MT를 창자에서 분리하고 요관이 닫힙을 닫습니다.
8. 튜블러가 양쪽으로 떨어질 수 있도록 우세 아래 막대를 슬라이딩하여 당겨지는 유리 막대로 무료 전방 MT를 집어 들수 있습니다. MT를 솔루션에서 바로 들어올립니다.
9. MT와 요관이 막대 의 밑면에 부착되어 요관을 슬라이드로 똑바로 낮추도록 유리 막대를 켭니다. 요관을 부착하고 유리 슬라이드(도 2B)에우초를 아래로 눌러 MT의 말단 끝을 밀봉합니다. 필요 이상으로 MT를 조작하지 마십시오. MT는 슬라이드에 고정된 요관과 함께 용액에 떠 있어야 합니다.
10. 유리 막대의 미세한 끝을 사용하여 슬라이드 표면을 가로질러 각 튜블러를 부드럽게 쓸어 냅니다. 슬라이드에 막대를 버팀목으로 분쇄하지 않도록 막대를 밀어 내고, 부활하게 이동하여 PLL 코팅슬라이드(그림2C)의표면에 각 튜블러의 전체 길이를 부착합니다.
11. 접착제 관류-잘 분배를 슬라이드에 다시 배치하여 장착 된 튜블러 위에 작은 유체로 채워진 우물을 형성합니다.
12. 현미경 단계에 표본을 놓습니다. 유입 및 유출 모세혈관을 인퓨전의 입구 및 출구 개구부 위에 각각 배치한다.
    참고: 개방관혈실이 원하는 경우 웰 디바이더를 제외할 수 있습니다. 이 경우 유입 및 유출 모세혈관은 이미징의 반대쪽에 잘 정렬될 수 있다.

Representative Results

그림 1: 말피기안 튜벌레를 처리하기 위한 유리 막대 를 제작합니다.
A - E. 가열 및 MT를 처리하는 데 적합한 테이퍼와 각도를 생성하기 위해 유리 막대를 당기는 과정. 화살표는 적용될 힘의 방향과 크기를 나타냅니다. F. 적절하게 조작 된 유리 도구의 사진. 스케일 바 = 10mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 성인 드로소필라 전방 말피기안 투덜스의 해부.
차가운 슈나이더의 매체에 2 쌍의 미세 집게와 전방 MT 제거의 회로도 표현. "A. Tubule" = 전방 MT. "P. Tubule" = 후방 MT. B. 얇은 유리 막대를 사용하여 추출 된 MT를 검색하고 장착하는 과정. C.추출된 MT의 전체 길이를 이미징 및 생리적 평가를 위한 슬라이드에 고수하는 과정. D.대표적인 와이드필드 이미지SEpH(470/510 nm ex/em) 및 mCherry(556/630 nm ex/em) 구성 요소인 CapaR-GAL4가 구동하는 UAS-pHerry의 구성 요소는 건강한 전방 MT를 묘사하고 있습니다. 전방 MT가 부족한 관류에 의해 손상되고, 잘못 식별된 후방 MT. 건강한 전방 MT는 명확한 확장된 블라인드 초기 세그먼트, capaR-GAL4에의해 구동될 때 UAS-pHerry의 상대적으로 증가한 발현을 가진 수축된 과도기 세그먼트, 및 황실 메인 세그먼트를 표시한다는 점에 유의하십시오. 손상된 MT는 해당 SEpH 형광없이 mCherry 형광의 눈에 띄는 골재를 표시합니다. 후방 MT는 형태학적으로 구별되는 세그먼트가 없는 직경이 균일합니다. 스케일 바 = 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Poly-L-Lysine (PLL) Solution	Sigma-Aldrich	P4832	Store at 4 °C, can be reused.
Adhesive Perfusion Chamber Covers, adhesive size 1 mm, chamber diameter × thickness 9 mm × 0.9 mm, ports diameter 1.5 mm	Sigma-Aldrich	GBL622105	Can be substituted as needed to match perfusion system.
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Ellsworth Adhesives	184 SIL ELAST KIT 0.5KG	Available from multiple vendors.
Helping Hands Soldering Stands	Harbor Freight Tools	60501	Available from multiple vendors.
Schneider's Medium	Fisher Scientific	21720024	Store at 4 °C in sterile aliquots.
#5 Inox Steel Forceps	Fine Science Tools	11252-20	Can be substituted based on experimenter comfort.
35 x 10 mm polystyrene Petri dish	Corning Life Sciences	Fisher Scientific 08-757-100A	Exact brand and size are unimportant.
75 x 25 mm Microscope Slides	Corning Life Sciences	2949-75X25	Exact brand and size can vary as long as perfusion wells are compatible.
Filimented Borosilicate Capillary Glass, ID 1.5 mm, OD 0.86 mm, thickness 0.32 mm	Warner Instruments	64-0796	Filiment not necessary, glass can be substituted to match perfusion tubing and perfusion wells.
Vacuum Silicone Grease	Sigma-Aldrich	Z273554	Available from multiple vendors.
Glass rods, 5 mm diameter	delphiglass.com	9198	Exact size is personal preference, multiple vendors available
PAP Hydrophobic Pen	Sigma-Aldrich	Z377821	Available from multiple vendors.
Sealing Film	Sigma-Aldrich	P7668	Available from multiple vendors.
15 mL Falcon tube	BD Falcon	352096	Available from multiple vendors.
50 mL Falcon tube	BD Falcon	352070	Available from multiple vendors.
Dissecting Stereoscope	Zeiss	Discovery.V8	Any dissecting stereoscope can be used.
UAS-pHerry transgenic Drosophila melagnogaster	Available from Romero Lab		First published: Rossano et al., 2017
capaR-GAL4 driver line Drosophila melagnogaster	Available from Romero Lab		First published: Terhzaz et al., 2012
c724-GAL4 driver line Drosophila melagnogaster	Available from Romero Lab		First published: Sozen et al., 1997
Single-edged Carbon Steel Razor Blade	Electron Microscopy Sciences	71960	Available from multiple vendors.
Microscopy Slide Folder	Fisher Scientific	16-04	Available from multiple vendors.
Bunsen Burner	Fisher Scientific	50-110-1231	Available from multiple vendors.
Polystrene Drosophila Rearing Vials with Flugs	Genesee Scientific	32-109BF	Comparable items can be substituted.
2.5 L Laboratory Ice Bucket	Fisher Scientific	07-210-129	Available from multiple vendors.
200 uL barrier pipette tips	MidSci	AV200	Available from multiple vendors.
200 μL variable volume pipette	Gilson Incorporated	PIPETMAN P200	Available from multiple vendors.