Este protocolo é um trecho de Eidhof et al., Análise de alto rendimento do comportamento locomotor no ensaio da ilha de Drosophila, J. Vis. Exp. (2017).
1. Construção da Caixa de Ensaio da Ilha
- Prepare uma bandeja feita de um material robusto, como polimetilmetacrilato (PMMA), para conter uma camada de água (ou seja, um banho). Certifique-se de que o material não seja branco.
OBSERVAÇÃO: Dimensões de 40 x 35 x 2,5 cm3 são recomendadas (Figura 1A).
- Preparar uma caixa (42 x 38 x 25 cm3) feita de um material robusto e transparente, como o PMMA, para ser colocada à volta da banheira para evitar que as moscas escapem para o espaço do laboratório. Coloque um orifício (20 x 30 cm2) na lateral que seja grande o suficiente para que o experimentador manuseie facilmente os frascos com moscas e os solte na ilha (Figura 1A).
- Prepare uma plataforma elevada de 10 x 15 x 2,5 cmde 3 polegadas, feita de um material impermeável (PMMA ou plástico) que seja estanque.
OBSERVAÇÃO: Esta plataforma deve ter uma superfície branca uniforme para garantir um bom contraste para análise de imagem. O tamanho não é necessariamente fixo, mas deve ser grande o suficiente para garantir que todas as moscas pousem inicialmente na plataforma e tenham a chance de andar sobre ela (Figura 1A).
- Fixe a plataforma colando-a na banheira ou colocando pesos ou outros objetos pesados dentro da caixa da plataforma para evitar mudanças de posição da plataforma durante a sessão experimental/de filmagem.
2. Requisitos de software e instalação
- Instalação de software de gravação de imagens.
- Baixe o software de gravação de imagens para gravar a série de imagens da ilha (consulte a Tabela de Materiais) e instale o software em um computador.
OBSERVAÇÃO: O software de gravação de imagens descrito neste protocolo é suportado apenas pelo Windows. Uma alternativa para outros usuários foi adicionada à Tabela de Materiais.
3. Preparação das moscas a testar no ensaio da ilha
- Colete moscas estadiadas para cada condição experimental sob anestesia a frio ou dióxido de carbono (CO2), conforme descrito anteriormente (durante um período de 1 a 2 dias).
- Prepare um mínimo de 3 frascos de amostra por condição experimental, cada um contendo aproximadamente 15 moscas estadiadas. Use apenas moscas com asas intactas e que tenham idade e sexo semelhantes.
OBSERVAÇÃO: Para as experiências aqui descritas, foram utilizados 5 frascos para injetáveis contendo 15 moscas machos dos genótipos w-; Actina-Gal4/+ (controle) e w-; Actin-Gal4/GD11950 (tefu RNAi) foram coletados no dia da eclosão, envelhecidos por 4 dias, e foram utilizados para realizar o ensaio em ilha. RNAi, cepas de controle e o driver Actin-gal4 foram obtidos de uma fonte comercial (consulte a Tabela de Materiais).
- Deixe as moscas se recuperarem para evitar os efeitos dos anestésicos (pelo menos 1 dia ao usar CO2) antes de testar as moscas coletadas no ensaio da ilha na idade de interesse.
4. Configuração experimental
NOTA: Consulte Figura 1B.
- Adicione água fria com uma pequena quantidade de sabão na bandeja do banho e posicione a plataforma no meio.
OBSERVAÇÃO: O sabão diminui a tensão superficial da água; As moscas que tocam a água se afogam. Isso evita o aumento da quantidade de moscas voando na caixa durante a progressão da sessão experimental.
- Coloque a caixa transparente em cima da bandeja e ilumine a plataforma por cima usando uma lâmpada.
OBSERVAÇÃO: A iluminação da plataforma é necessária principalmente para garantir o contraste de vídeo adequado. Uma luz LED comum de 12 V é apropriada para isso.
- Posicione a webcam diretamente acima da plataforma (fora da caixa) e conecte-a a um computador.
- Crie novas pastas no computador para armazenar os diferentes dados experimentais antes dos experimentos.
- Siga a estrutura do exemplo ilustrado em Figura 2A para criar as pastas. Por exemplo, se o projeto experimental exigir o teste de dois genótipos com cinco repetições cada, primeiro crie uma pasta principal contendo a data do experimento. Dentro da pasta principal, crie duas subpastas (uma por genótipo). Dentro das pastas de genótipo, crie cinco novas subpastas, uma por replicate.
OBSERVAÇÃO: Para uma análise mais aprofundada, é essencial que a série de imagens correspondente a experimentos individuais seja salva em pastas com nomes exclusivos.
5. Configuração das configurações de vídeo na seção "Dispositivo de captura" da interface
- Abra o software de gravação de imagens e, na guia "Capturar", clique em "Imagens com lapso de tempo..." e selecione a webcam apropriada como "Dispositivo de captura".
- Coloque uma mosca morta na ilha; ajuste as configurações de vídeo clicando na caixa "Configurações de vídeo". Percorra as barras de ferramentas, ajustando o brilho, o contraste e a cor de forma que a mosca morta apareça preta em um fundo branco (Figura 2B). Quando os ajustes estiverem concluídos, clique em "Ok".
6. Configuração das configurações de gravação e salvamento de vídeo na seção "Time-lapse" da interface
- Ajuste as definições na "Configuração de filme com lapso de tempo" para guardar a experiência como um ficheiro .avi. Clique em "Procurar...", selecione o diretório onde o filme será armazenado, defina o nome do vídeo e pressione "salvar".
OBSERVAÇÃO: O arquivo de vídeo não é usado para a quantificação de dados; no entanto, pode ser útil ter uma ideia geral sobre o experimento.
- Ajuste as definições na secção "Configuração de filme time-lapse".
- Na caixa de compactação, selecione "Código Intel IYUV" para compactação de vídeo e escolha "Tirar um quadro a cada 0,1 segundos", com a "Taxa de reprodução (imagens por segundo):" em 10.
- Salve a série temporal do experimento como .bmp quadros clicando em "Avançado..." Selecione "Criar uma imagem .bmp para cada quadro capturado". Clique em "Procurar". Selecione o mesmo diretório na janela "Durante a captura de filmes AVI" (conforme escolhido na etapa 6.1), clique em "Abrir" e pressione "Ok".
OBSERVAÇÃO: Observe que, durante o experimento, os quadros são armazenados como arquivos .bmp (necessários para análise de dados). O programa nomeia os quadros como "A" seguido pelo número correspondente à sequência de captura de quadros (por exemplo, "A_number.bmp") (Figura 2C). Sempre salve as imagens pertencentes a diferentes experimentos em uma nova pasta para garantir que as séries de imagens gravadas anteriormente não sejam substituídas. Esteja ciente de que as imagens não são salvas automaticamente na mesma pasta que o arquivo de vídeo, a menos que esta pasta seja selecionada em "Procurar..." ao clicar na caixa "Avançado".
7. Ensaio de ilha e coleta de dados
- Pressione o botão Iniciar na interface de imagem com lapso de tempo do software de gravação de imagem para iniciar a gravação.
- Bata no frasco experimental contendo moscas (etapa 3) 2-3 vezes para garantir que as moscas estejam no fundo do frasco. Remova rapidamente o plugue do frasco e, com um movimento vigoroso, bata no frasco na plataforma para que todas as moscas caiam na plataforma ao mesmo tempo ( Figura 1C).
- Após aproximadamente 30 s, pressione o botão "Parar" para interromper a gravação.
OBSERVAÇÃO: Se todas as moscas desaparecerem da plataforma, a gravação pode ser interrompida mais cedo.
- Remova as moscas que permanecem por 30 s na plataforma manualmente após interromper a gravação da imagem.
- Antes de prosseguir com a gravação do próximo experimento, altere o diretório de destino para os arquivos e filmes .bmp (consulte a seção 6).
