Este protocolo é um trecho de Bovier et al., Métodos para testar a desregulação endócrina em Drosophila melanogaster, J. Vis. Exp. (2019).
1. Preparação de alimentos
- Para manutenção do estoque e para o crescimento larval, use um meio de fubá contendo 3% de fermento em pó, 10% de sacarose, 9% de fubá pré-cozido, 0,4% de ágar, doravante chamado de meio de fubá (CM).
- Coloque 30 g de fermento em 100 mL de água da torneira, leve para ferver e deixe ferver por 15 min.
- Separadamente, misture bem 90 g de fubá pré-cozido, 100 g de açúcar e 4 g de ágar em 900 mL de água da torneira.
- Leve a solução para ferver, abaixe o fogo e cozinhe por 5 minutos, mexendo continuamente.
- Após 5 minutos, adicione a solução de fermento quente e cozinhe por mais 15 min.
- Desligue a fonte de calor e deixe a solução arrefecer até cerca de 60 °C.
- Adicione 5 mL/L de 4-hidroxibenzoato de metila 10% em etanol, misture bem e deixe descansar por 10 min.
OBSERVAÇÃO: Tenha cuidado com a quantidade de 4-hidroxibenzoato de metila, visto que uma alta concentração de fungicida pode ser letal para as larvas.
- Dispense o meio em frascos / frascos: 8 mL em cada frasco para moscas (25 mm x 95 mm), 3 mL em cada frasco para moscas (22 mm x 63 mm) e 60 mL em cada frasco para moscas (250 mL).
- Cubra os frascos com gaze e deixe-os secar à temperatura ambiente (RT) por 24 h antes do armazenamento.
- Calibre experimentalmente a consistência e a hidratação corretas do CM, modificando a quantidade de ágar usada e/ou os tempos de resfriamento/secagem.
NOTA: frascos para injetáveis desconectados, embalados e embalados são estáveis por cerca de 15 dias a 4 °C.
- Para adultos de Drosophila, use um meio contendo 10% de fermento em pó, 10% de sacarose, 2% de ágar, doravante chamado de meio adulto (AM).
- Misture 10 g de fermento em pó, 10 g de sacarose, 2 g de ágar em 100 mL de água destilada.
- Leve esta mistura para ferver duas vezes, com um intervalo de 3 minutos, ou até que o ágar se dissolva, usando um micro-ondas.
- Assim que a solução esfriar a 60 ° C, adicione 5 mL / L de 4-hidroxibenzoato de metila a 10% em etanol, misture bem e distribua em frascos (10 mL por frasco).
- Cubra os frascos com gaze e deixe-os secar em RT por 24 h antes de guardá-los.
NOTA: frascos para injetáveis desconectados, embalados e embalados são estáveis por cerca de 15 dias a 4 °C.
2. Dosagem de Drosophila EDC
- Preparar uma solução-mãe adequada, dissolvendo o EDC seleccionado no solvente adequado. Para o EE2 (peso molecular 296,403), dissolver 1,48 g em 10 mL de etanol a 100% para fazer uma solução estoque 0,5 M e armazenar a -80 °C.
cuidado: Os EDCs são considerados poluentes ambientais e devem ser tomadas precauções ao manuseá-los.
- Diluir a solução-mãe EE2 em etanol a 10% em água (v/v) para obter uma solução de 100 mM. Efectuar as próximas diluições (0,1 mM, 0,5 mM e 1 mM) em alimentos com CM, começando com a concentração mais baixa e utilizando a mesma concentração final de solvente para cada grupo de tratamento. Para os frascos de controle, use o mesmo volume do solvente sozinho.
NOTA: recomenda-se manter a concentração final do solvente o mais baixa possível, tendo em conta que a concentração final de etanol não deve exceder 2% nos alimentos para moscas.
- Adicione a solução contendo a diluição correta do EDC selecionado ao alimento à base de fubá antes da solidificação, misture bem com um processador de alimentos, dispense 10 mL em frascos, cubra com gaze de algodão e deixe secar em RT por 16 h antes de usar.
NOTA: use este meio imediatamente após sua preparação.
- Para a criação de adultos, preparar diferentes soluções de EE2 de trabalho (10 mM, 50 mM e 100 mM, respectivamente) em etanol a 10% em água (v/v) e camada de 100 μL de cada uma sobre a superfície do AM, a fim de obter a concentração desejada do EE2 (0,1 mM, 0,5 mM e 1 mM). Para o controle, use o mesmo volume do solvente sozinho.
NOTA: alternativamente, adicione a solução contendo a diluição correta do EDC selecionado a uma pequena quantidade de AM em um tubo cônico de 50 mL, vortex completamente e estratifica 1 mL dele na superfície dos frascos para AM.
- Cubra os frascos com gaze de algodão, deixe secar em RT por 12-16 h sob agitação suave e use-os imediatamente.
NOTA: o processo de secagem deve ser ajustado experimentalmente porque depende da umidade ambiente.
3. Criação de moscas
- Use uma cepa isogênica robusta, como Oregon R, mantida por várias gerações em laboratório.
- Manter as moscas numa incubadora humidificada e com temperatura controlada, com luz natural de 12 h: fotoperíodo escuro de 12 h a 25 °C em frascos para injetáveis contendo alimentos CM.
- Em cada ensaio, use frascos para injetáveis em RT.
4. Protocolo de Vida Útil
- Configure 20 frascos de moscas com 8 fêmeas e 4 machos e aloje a 25 ° C em CM (10 mL cada).
- Após 4 dias, descarte as moscas e coloque os frascos de volta na incubadora.
NOTA: essas moscas podem ser usadas para começar de novo para obter outras coortes sincronizadas com a idade das moscas.
- No final da tarde do dia 9, retire todas as moscas recém-fechadas dos frascos e devolva os frascos para a incubadora.
NOTA: alguns adultos devem começar a fechar já no nono dia; O descarte dessas moscas permite coletar um número máximo de moscas sincronizadas, evitando a seleção descuidada de emergentes precoces.
- 16-24 h depois, transfira as moscas adultas (1 dia de idade) de ambos os sexos para quatro grupos de frascos de 250 mL contendo alimentos AM suplementados com três concentrações diferentes de EDC e um apenas com o solvente. Se necessário, colete outro lote no dia seguinte.
- Mantenha as moscas a 25 °C por 2-3 dias para permitir que elas acasalem.
NOTA: o dia da transferência para frascos de alimentos AM corresponde ao primeiro dia da idade adulta.
- Após dois ou três dias, classifique cada coorte de moscas por sexo em dois grupos sob anestesia leve com CO2. Subdividir aleatoriamente cada sexo em cinco frascos por tratamento a uma densidade de 20 indivíduos por frasco, até que haja três repetições de 5 frascos paralelos para cada gênero por cada tratamento.
OBSERVAÇÃO: Trabalhe com pequenos grupos de moscas para evitar possíveis problemas de saúde duradouros devido ao longo tempo de exposição ao CO2.
- Prepare uma planilha de tempo de vida na qual o número de moscas mortas seja subtraído do número de moscas sobreviventes para a transferência anterior, de forma a obter automaticamente o número de sobreviventes em cada transferência.
- Transfira as moscas para novos frascos contendo o alimento correspondente a cada 3 dias ao mesmo tempo e verifique se há morte.
NOTA: a transferência deve ocorrer sem anestesia que possa ter um efeito negativo a longo prazo na longevidade da mosca.
- A cada transferência, registre a idade das moscas e o número de moscas mortas.
NOTA: o número de moscas sobreviventes é calculado automaticamente na planilha, mas é recomendável verificá-lo visualmente. As moscas que escapam acidentalmente ou morrem durante a transferência não devem ser consideradas. Tenha cuidado para não contar duas vezes as moscas mortas transportadas para o novo frasco que relata esta nota na planilha.
- Repita as etapas 4.8 e 4.8.1 até que todas as moscas morram.
- Para cada grupo de tratamento, crie uma curva de sobrevivência conforme mostrado em Figura 1, a fim de exibir a probabilidade de sobrevivência de uma mosca em um determinado momento.
- Realize três experimentos independentes para cada grupo de tratamento de moscas, usando 100 moscas recém-fechadas para cada experimento.
- Prepare uma tabela para relatar a expectativa de vida média (média de dias de sobrevivência de todas as moscas para cada grupo), o tempo de meia morte (período de tempo em dias necessário para atingir 50% de mortalidade) e a expectativa de vida máxima (quantidade máxima de dias necessários para atingir 90% de mortalidade).
- Calcule as diferenças percentuais entre cada grupo de tratamento em relação ao grupo controle.
- Realize análises estatísticas para comparar os diferentes grupos de tratamento.
