drosófila Quantificação da Junção Neuromuscular (NMJ): Um Método para Avaliar a Morfologia e Função Sináptica

Este protocolo é um trecho de Castells-Nobau et al., Dois algoritmos para quantificação multiparamétrica e de alto rendimento da morfologia da junção euromuscular de Drosophila N, J. Vis. Exp. (2017).

1. Requisitos antes do processamento de imagens

1. Realize preparações de livro aberto de Drosophila de larvas errantes de terceiro ínstar (L3), conforme descrito anteriormente.
2. Co-imunomarcar terminais Drosophila NMJ usando uma combinação de dois marcadores: Dlg-1 ou Hrp junto com Brp para análise com "Drosophila NMJ Morphometrics", e Syt ou Csp junto com Brp para análise com "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics".
   OBSERVAÇÃO: Anticorpos da mesma espécie podem ser combinados pré-rotulando um com um kit de conjugação de anticorpos, como os kits de rotulagem Zenon Alexa.
3. Visualize os terminais NMJ usando um microscópio de sua escolha, por exemplo, fluorescência (com ou sem ApoTome) ou microscopia confocal.
   1. Adquira uma pilha de imagens de 2 canais do terminal NMJ.
      1. Ajuste as configurações do microscópio de forma que o canal 1 adquira o terminal NMJ imunomarcado com Dlg-1 (ou Hrp, Syt, Csp) e o canal 2 o terminal NMJ imunomarcado com Brp.
      2. Opcionalmente, analise imagens de um canal (de sinapses imunomarcadas com um único anticorpo) com as macros. Os NMJs de imagem imunomarcados exclusivamente com Dlg-1 ou Hrp para análise com "Drosophila NMJ Morphometrics", ou Syt ou Csp para "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics".
         OBSERVAÇÃO: Não é possível analisar sinapses imunomarcadas apenas com anti-Brp.
   2. Exporte as imagens obtidas como arquivos .tiff individuais. Inverta a ordem dos canais antes de executar as macros se não forem adquiridas conforme indicado.

2. Requisitos de software e instalação

1. Baixe as macros: "Drosophila NMJ Morphometrics" e "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics" do seguinte site: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.2077399.v1.
2. Mova o cursor para a pasta "Atualização de macros 1" e clique na opção que aparece "visualizar". Uma lista com o conteúdo desta pasta aparecerá. A pasta contém as macros "Drosophila NMJ Morphometrics" e "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics".
   OBSERVAÇÃO: Ambas as macros são compatíveis com as versões 1.4 do Fiji, que também são fornecidas na mesma pasta. As macros podem não ser executadas em versões recentes. Utilize a versão 1.4 fornecida. Não é problemático iniciar esta versão, mesmo em computadores com uma versão mais recente de Fiji disponível.
3. Clique em "Baixar tudo". O conteúdo da pasta será baixado para o computador como um arquivo .zip. Descompacte o arquivo baixado.
4. Copie os arquivos Drosophila_NMJ_Morphometrics.ijm e Drosophila_NMJ_Bouton Morphometrics.ijm para Fiji.app/plugins/ diretório. Ao reiniciar o programa, as macros aparecerão na parte inferior do menu suspenso Plug-ins.

3. Execute a submacro "Convert to Stack" para criar projeções Z e Hyperstacks das imagens NMJ

1. Inicie a interface gráfica selecionando Plugins na barra de ferramentas e escolha "Drosophila NMJ Morphometrics" no menu suspenso.
2. Defina a configuração "Unique File String" na interface gráfica da macro.
   OBSERVAÇÃO: O software do microscópio usa uma assinatura de identificação para organizar planos e canais ao armazenar pilhas como arquivos .tiff individuais. A configuração de string de arquivo exclusiva inserida precisa especificar a assinatura atribuída pelo software ao primeiro plano do primeiro canal (importante: o plano mais baixo e o número do canal precisam ser indicados).
3. Selecione apenas a submacro "Converter em pilha" e clique em "ok" e selecione a pasta onde as imagens estão localizadas. Se um diretório principal com várias subpastas for selecionado, todos os arquivos individuais do '.tiff dentro do diretório principal e da subpasta que corresponderem aos critérios exclusivos da string de arquivo serão processados.
   1. Se a pilha z contiver apenas um canal, marque a caixa "Somente canal 1".
4. Observe que dois novos arquivos por imagem NMJ, por padrão denominados como stack_image_name e flatstack_image_name aparecerão. Armazene apenas essas pilhas e pilhas planas para análise posterior. A série de arquivos .tiff pode ser excluída neste ponto, minimizando as capacidades de armazenamento necessárias e evitando possíveis fontes de erro.

4. Execute a submacro "Definir ROI" para delinear o terminal NMJ de interesse

1. Inicie a interface gráfica de "Drosophila NMJ Morphometrics".
2. Marque apenas a caixa de seleção "Definir ROI" e pressione "OK" e selecione o diretório principal onde as imagens intituladas flatstack_name estão armazenadas e pressione "Selecionar". A submacro "Definir ROI" pesquisa automaticamente em todas as subpastas dentro do diretório principal selecionado.
3. Quando a primeira projeção for aberta, selecione a ferramenta "Seleções à mão livre" na barra de ferramentas.
4. Usando o mouse, desenhe uma seleção que contenha exclusivamente o terminal NMJ completo de interesse e clique em "OK" na janela "Definir terminal". A macro prosseguirá com a próxima projeção.
5. Delineie o próximo ROI e repita até que todos os ROIs sejam definidos. O arquivo de imagem ROI, denominado "roi_image_name", será armazenado no mesmo diretório que as imagens de pilha e projeção geradas anteriormente para cada uma das imagens processadas. A saída dessa submacro é uma imagem binária do ROI em branco sobre um fundo preto.

5. Execute a submacro "Analisar" para quantificar os recursos do terminal NMJ

1. Vá para a barra de ferramentas, selecione "Plugins" e use:
   "Drosophila_NMJ_Morphometrics" ao analisar sinapses imunomarcadas com anti-Dlg-1 ou anti-Hrp (canal 1) junto com anti-Brp (canal 2), ou "Drosophila_NMJ_Bouton_Morphometrics" ao analisar sinapses imunomarcadas com anti-Syt ou anti-Csp (canal 1) junto com Brp (canal 2).
   1. Quando as pilhas de imagens de um canal devem ser analisadas (o canal estrutural Dlg-1 ou HRP para "Drosophila_NMJ_Morphometrics", ou Syt ou Csp para "Drosophila_NMJ__Bouton_Morphometrics"), selecione a caixa "Somente canal 1".
2. Ajuste a escala correspondente às imagens a serem analisadas.
   1. Se um pixel na imagem corresponder a 2,5 μm, indique Scale-Pixels = 1, Scale-Distance em μm = 2,5. Caso ambas as configurações sejam deixadas em 0, a área NMJ, o perímetro, o comprimento e o comprimento da ramificação mais longa serão expressos em número de pixels.
3. Se necessário, ajuste as configurações de análise padrão da macro. Execute ajustes somente se a submacro "Analisar" tiver sido executada anteriormente com resultados insatisfatórios (consulte o final desta seção e a seção 6 para obter instruções sobre como otimizar as configurações).
4. Marque as caixas de seleção "Analisar" e "Aguarde" e pressione "OK".
   1. Marque a caixa de seleção "Aguardar" ao executar a submacro "Analisar" em imagens de 2 canais. Caso contrário, erros na contagem de zonas ativas podem ocorrer devido a capacidades limitadas do computador.
5. Quando uma nova janela "Escolha um diretório" for aberta, selecione o diretório onde as imagens estão localizadas e pressione "selecionar". A macro analisará todas as imagens armazenadas no diretório principal e, se aplicável, nas pastas subsequentes (usando os três arquivos da execução das submacros anteriores: stack_image_name, flatstack_image_name e roi_image_name). A macro processa cada imagem individualmente e consecutivamente. Isso pode levar vários minutos por pilha de imagens (dependendo da capacidade do computador).
6. Depois de executar a macro, observe que um novo arquivo de imagem chamado res_image_name para cada sinapse analisada armazenada será criado na pasta pai. As medições quantitativas serão armazenadas como arquivo "results.txt".
7. Inspecione todas as imagens de resultado para detectar e excluir imagens com erros de segmentação. Possíveis erros de segmentação são descritos na Tabela 1, juntamente com conselhos sobre como ajustar as configurações para contornar esses erros. Imagens de resultados com tais erros de segmentação são fornecidas como exemplos em Figura 1.
   OBSERVAÇÃO: Ao executar a macro com as configurações padrão observadas na interface do usuário, houve uma precisão de aproximadamente 95% quando a avaliação de macro foi comparada à avaliação manual.

6. Ajuste as configurações de macro para as imagens

1. Quando mais de 5% das imagens apresentarem erros de segmentação, explore os diferentes algoritmos para definir/escolher as configurações de macro mais adequadas para as imagens.
2. Ajuste o valor do raio da bola rolante
   OBSERVAÇÃO: A função de raio da bola rolante subtrai o plano de fundo da imagem. Esta função é de importância crucial ao trabalhar com imagens adquiridas em microscópios de fluorescência e/ou quando as imagens apresentam alto ruído de fundo. A subtração do plano de fundo ajudará as etapas de limite automático da macro a produzir uma segmentação adequada dos terminais NMJ.
   1. Selecione três imagens NMJ stack_image_name geradas pela submacro "Converter em pilha". Escolha imagens que sejam representativas do conjunto de dados de imagens.
   2. Na barra de ferramentas, selecione Imagem | Cor | Canais divididos. Duas pilhas de imagens serão criadas, uma representando o canal 1 e a outra o canal 2, respectivamente, e salvá-las.
   3. Abra a pilha de imagens pertencente ao canal 1 aberta, correspondendo à imunomarcação Dlg-1, Hrp, Syt ou Csp.
   4. Execute o filtro "Subtrair plano de fundo" selecionando "Processar" na barra de ferramentas seguido de "Subtrair plano de fundo..." no menu suspenso.
   5. Clique na caixa de seleção de visualização na janela pop-up e ajuste o raio da bola rolante para o valor mais apropriado para as imagens. A configuração "Raio da bola rolante" deve ser ajustada para valores que aumentem o contraste entre a sinapse e o fundo (consulte Figura 2A').
      1. Consulte Figura 2 para obter um exemplo. No painel A, partes da sinapse mostram os mesmos níveis de cinza que o fundo, enquanto em Figura 2 painel A' um "raio de bola rolante" de 500 resulta em forte contraste entre a sinapse e o fundo.
   6. Crie uma projeção z selecionando na barra de ferramentas Imagem | Pilha| Projeção Z, escolha Tipo de projeção = Intensidade máxima e salve a imagem resultante. Quando o valor apropriado para o raio da bola rolante for definido, execute o algoritmo "Subtrair fundo" nas imagens representativas restantes com o mesmo valor de raio da bola rolante. Crie as projeções Z e salve-as (em qualquer diretório).
      OBSERVAÇÃO: O valor do raio da bola rolante para imagens RGB ou de 8 bits deve ser pelo menos tão grande quanto o raio do maior objeto na imagem que não faz parte do plano de fundo. Para imagens de 16 bits e 32 bits, o raio deve ser inversamente proporcional ao intervalo de valores de pixels.
3. Determine os diferentes limites automáticos que serão usados
   1. Abra as projeções Z salvas na etapa anterior (6.2.6) e selecione Imagem | Ajustar | Limiar Automático | Experimente tudo.
   2. Como uma imagem de resultado com limite binário aparecerá com todos os diferentes algoritmos de limite automático, determine o algoritmo mais adequado para as imagens.
      1. Ao executar a macro posteriormente, altere o limite nas configurações da macro de acordo.
      2. Use limiares mais restritivos, como "RenyiEntrophy" ou "Moments" como o limite de contorno NMJ e limiares mais permissivos, como "Li" para determinar o esqueleto NMJ e "Huang" para determinar zonas ativas. Quando as imagens estiverem muito nítidas com pouco ou nenhum fundo, use "Huang" como "limite de contorno NMJ". Caso contrário, partes da sinapse podem estar ausentes após a segmentação da imagem.
      3. Consulte Figura 2B para obter um exemplo. A segmentação apropriada da sinapse é obtida com limiares automáticos destacados por caixas verdes. Alguns exemplos de limiares não adequados são destacados por caixas vermelhas (verifique as sinapses em alta ampliação). Neste último, partes da sinapse estão faltando ou partes do fundo estão incluídas.
4. Determine o tamanho máximo das partículas pequenas
   OBSERVAÇÃO: Esta função excluirá da análise todas as partículas detectadas pelo limite de contorno NMJ e pelo limite de esqueleto que sejam menores que o valor definido na "configuração de partículas pequenas". Esse valor é definido em pixels. Esta função serve como um filtro de ruído e é muito útil quando altas taxas de fundo não uniforme (como cristais/poeira) estão presentes nas imagens obtidas.
   1. Abra as projeções Z salvas na etapa 6.2.6. e defina a escala para detectar o número de pixels por meio de Analisar | Definir escala. Aplique as seguintes configurações: distância em pixels = 1, distância conhecida = 1, proporção de pixel = 1, Unidade de comprimento = pixel e pressione "Ok". Clique na ferramenta "Seleção oval" na barra de ferramentas.
   2. Usando o mouse, desenhe uma seleção em torno de partículas únicas que estão presentes na imunocoloração, mas não pertencem à NMJ. Pressione Ctrl+m para um usuário do Windows ou cmd+m para usuários do Mac. Uma janela de resultados será aberta, indicando a área das partículas selecionadas em número de pixels.
   3. Repita a etapa anterior várias vezes com vários artefatos presentes nas imagens para determinar a maior área de partícula/artefato contaminante. Este será o valor a ser definido na configuração ao executar a macro posteriormente. Ao executar a macro, defina o "Tamanho de partículas pequenas" como o menor tamanho de partícula observado com uma margem de 25%.
   4. Veja Figura 2D para um exemplo. O maior cristal detectado tem uma área de 112 pixels. A configuração "Tamanho de partículas pequenas", ao processar esta imagem com a macro, deve ser definida como 125 - 150.
5. Determine o tamanho mínimo do botão
   OBSERVAÇÃO: Esta função excluirá da análise todos os botões detectados pelo limite de contorno NMJ que são menores que o valor definido. Esse valor é definido em pixels.
   1. Siga os mesmos passos descritos na seção 6.4, mas, neste caso, desenhe uma seleção em torno dos menores botões presentes no terminal NMJ. Escolha a menor área correspondente ao menor botão dos medidos. Este é o valor a ser definido na configuração de tamanho mínimo do botão ao executar a macro posteriormente.
6. Defina o valor "Tolerância máxima ao ruído"
   1. Para definir o valor "Encontrar tolerância máxima ao ruído" para a macro, abra a pilha Z do canal 2 salva na seção 6.2.2.
   2. Vá para a guia de plug-ins no menu pop-up, selecione Processo | Máximo(3D) e quando o maximum_image_name aparecer (o que pode levar alguns minutos), feche a pilha de imagens original.
   3. Selecione o Maximum..._image_name (a pilha de imagens recém-obtida) e selecione Plug-ins | Processo | Mínimo (3D), quando a nova imagem Mínimo de Maximum..._image_name aparece perto da pilha Máximo... _image_name
   .
   4. Na barra de ferramentas, selecione Processo | Encontre máximos.... Uma nova janela "Find maxima..." será aberta. Clique na caixa de seleção "Seleção do ponto de visualização..." e preencha a caixa "Tolerância ao ruído" com a configuração de macro padrão 50. Os pontos máximos serão indicados na imagem como pequenas cruzes.
      1. Aumente o valor de "Tolerância ao ruído" se observar um excesso de zonas ativas anotadas, ou seja, cruzamentos que não estão em cima de zonas ativas que não estão em foco no plano de pilha selecionado ou zonas ativas falsas que são detectadas em segundo plano.
         1. Por outro lado, se observar zonas ativas anotadas de forma incompleta, ou seja, zonas ativas em foco não reconhecidas, diminua o valor de "Tolerância máxima ao ruído". Continue tentando valores diferentes seguindo este procedimento até que as cruzes estejam rotulando adequadamente as zonas ativas em foco. Preencha a opção "Encontrar tolerância máxima ao ruído" com este valor.
         2. Consulte Figura 2C para obter um exemplo. Muitas zonas ativas são detectadas. Em Figura 2C', apenas as zonas ativas em foco são detectadas ao aumentar o valor de "Tolerância máxima ao ruído".
   5. Execute a submacro "Analisar" para as imagens representativas selecionadas na etapa 5.1, com as configurações definidas em todas as etapas anteriores.
7. Ajuste o limite inferior e superior do Brp-puncta
   1. Observe que um novo arquivo aparecerá após a execução da macro de acordo com a etapa 6.6, chamada 2_active_zone_stack_image_name. Nesta pilha de imagens, as zonas ativas detectadas pela função "Encontrar máximos" são indicadas por pontos brancos em cada plano.
   2. Abra este arquivo arrastando e soltando-o na barra de ferramentas e selecione Imagem | Pilha | Projeto Z | Tipo de projeção = Soma de fatias. Uma projeção do 2_active_zone_stack_image_name será obtida.
   3. Selecionar imagem | Ajustar | Limiar. Uma nova janela "Limiar" será aberta. Deslize a barra superior para escolher um valor limite onde todos os focos/pontos positivos para Brp desejados sejam visualizados em vermelho.
      OBSERVAÇÃO: Se o limite for definido muito baixo, um excesso de zonas ativas será contado. Se definido muito alto, uma fração das zonas ativas será perdida.
      1. Consulte Figura 2E para obter um exemplo. Quando o limite é definido como 400, a maioria das zonas ativas (simbolizadas como focos de 1 pixel) não são incluídas na segmentação, pois não são destacadas em vermelho (Figura 2E). Quando o limite é definido como um valor de 50, todas as zonas ativas são destacadas em vermelho (Figura 2E').
   4. Defina esse valor como limite mínimo. Deixe "Limite superior de pontos" no valor máximo.
   5. Execute novamente a submacro "Analisar" para as imagens representativas com as configurações definidas em todas as etapas anteriores desta seção. Avalie criticamente os arquivos de imagem resultantes e certifique-se de que a segmentação seja feita corretamente. Se não for esse o caso, reajuste as configurações de acordo com a natureza dos erros de segmentação (Figura 1, Tabela 1).

Figura 1: Exemplos de resultados inadequados de macrossegmentação. Imagens de resultados após a execução de "Drosophila NMJ Morphometrics" ou "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics". Partes do terminal sináptico não estão incluídas no contorno amarelo (A). Partes do fundo são incluídas no terminal sináptico pelo contorno amarelo (B). A linha de esqueleto azul se estende além do terminal sináptico (C - D). Muitas zonas ativas são detectadas (E - E'). Algumas zonas ativas permanecem não detectadas pela análise (G - G'). As zonas ativas são detectadas fora da sinapse (F). Segmentação incorreta de botões (aplicável apenas ao executar Drosophila NMJ Bouton Morphometrics), botões são perdidos (H) ou muitos botões são detectados pela segmentação (I). Partículas como cristais ou poeira que fazem parte do fundo são incluídas na segmentação (J). Informações sobre como alterar as configurações para evitar esses erros são fornecidas na Tabela 1. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Exemplos de ajustes de macroconfiguração e suas consequências para a segmentação de imagens. (A) Subtraia a visualização de fundo de uma sinapse imunomarcada Dlg-1, fotografada em um microscópio de fluorescência com ApoTome, quando "Raio da bola rolante" estiver definido como 20 (A) ou 500 (A'). (B) Imagens de saída obtidas após a execução de Image | Ajustar | Limite automático | Experimente todas as segmentações de imagem que ilustram imagens obtidas pelos 16 algoritmos diferentes de limite automático. (C) Pré-visualização "Encontrar Maxima" ao configurar "Tolerância ao ruído" em 50 (C) e 500 (C'); As zonas ativas detectadas pela segmentação são rotuladas por uma pequena cruz. (D) Medição das "pequenas partículas" que aparecem no fundo da imagem de uma sinapse imunomarcada com anti-Hrp, fotografada em um microscópio confocal. (E) Projeção de "fatias de soma" obtida do 2_active_zone_stack_ima-ge_name. O limiar é fixado em 400 (E) e em 50 (E'). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Guia de solução de problemas para os diferentes tipos de erros na segmentação de imagens que podem ser produzidos pelas macros. Esta tabela descreve diferentes tipos de erros de segmentação de imagem produzidos pelas macros. Estes podem ser facilmente detectados nas imagens de resultados. Exemplos de cada tipo de erro são mostrados na Figura 1. Na "seção de ajustes" da tabela, as configurações que precisam ser ajustadas são destacadas e o usuário é encaminhado para a subetapa crítica da seção 6, que descreve como ajustar essas configurações.