Lesão neural induzida por laser de dois fótons: um método para observar a degeneração e regeneração do axônio em larvas de Drosophila

Fonte: Li, D., et al. Um modelo de lesão in vivo de Drosophila para estudar a neuroregeneração no sistema nervoso periférico e central. J. Vis. Exp. (2018).

Este vídeo descreve a ablação a laser de dois fótons de axônios em uma larva de Drosophila melanogaster e um exemplo de protocolo para induzir lesão e imagem do local da lesão.

Este protocolo é um trecho de Li et al., Um modelo de lesão in vivo de Drosophila para estudar a neuroregeneração no sistema nervoso periférico e central, J. Vis. Exp. (2018).

1. Lesão de dois fótons e imagens confocais

Configuração do microscópio
OBSERVAÇÃO: Um microscópio confocal de varredura a laser com um laser de dois fótons foi usado para este experimento, mas outros sistemas com uma configuração equivalente também serão suficientes. O laser de dois fótons (930 nm) foi usado para aplicar lesões e um laser de argônio (488 nm) foi usado para imagens confocais de GFP.
1. No início de cada sessão, ligue o laser de dois fótons e/ou o(s) laser(s) confocal(is) e o microscópio. Abra o software de imagem.
2. Para lesão de dois fótons, configure os seguintes parâmetros para a imagem GFP com o laser de dois fótons a 930 nm (1.950 mW).
  1. Selecione o modo de varredura de linha. Abra o orifício até o fim. Aumente a intensidade do laser para ~20% (390 mW).
  2. Selecione 512 x 512 como a varredura de quadros. Use a velocidade máxima de varredura (normalmente com o tempo de permanência do pixel em 0,77 μs). Certifique-se de que o número médio seja 1 e a profundidade de bits seja de 8 bits.
  3. Defina o ganho para ~750 e o deslocamento para 0.
  4. Salve este protocolo experimental predefinido como ablação 2P GFP 930, permitindo fácil reutilização em experimentos futuros.
3. Para imagens confocais, configure os seguintes parâmetros para a imagem GFP com o laser de argônio a 488 nm:
  1. Selecione a guia Aquisição e, em seguida, pilha Z.
  2. Em "Laser", ligue a energia do laser de argônio de 488 nm.
  3. Vá para Canais, selecione o laser de 488 mm e aumente a potência do laser para 5-10%. Para o orifício, use a unidade 1-2 arejada (AU). Ajuste o ganho para 650.
  4. No Modo de aquisição, selecione 1024 x 1024 como a varredura de quadros, use a velocidade máxima de varredura, um número médio de 2 e profundidade de bits de 8 bits.
  5. Salve este protocolo experimental predefinido como GFP Imaging.
Anestesia de larvas com éter dietílico e montagem
1. Numa hotte, colocar uma placa de vidro de 60 mm numa placa de Petri de plástico de 15 cm. Dobre e coloque um pedaço de papel de seda no fundo do prato de vidro e, em seguida, coloque um prato de ágar suco de uva sobre o lenço de papel. Adicione éter dietílico no prato de vidro, até o ponto em que o lenço de papel fique encharcado e haja uma camada de éter líquido remanescente no prato. Mantenha a tampa sempre aberta.
2. Prepare uma lâmina de vidro com uma gota de óleo halocarbono 27 no centro. Adicione 4 pontos de graxa a vácuo nos quatro cantos da lâmina, para depois apoiar a lamínula.
3. Use uma pinça para pegar uma larva limpa e coloque-a na placa de ágar no prato de vidro de 60 mm. Cubra o prato de vidro com a tampa e espere até que a larva pare de se mover. Para lesão / imagem do PNS, retire a larva assim que sua cauda parar de se contorcer. Para o SNC, espere até que toda a larva fique imóvel, especialmente os segmentos da cabeça.
  OBSERVAÇÃO: O momento da exposição ao éter é crítico. Veja Discussão.
4. Pegue cuidadosamente a larva anestesiada e coloque-a de cabeça erguida na gota de óleo de halocarbono na lâmina. Adicione uma lamínula na parte superior do slide. Use uma leve pressão para empurrar a lamínula para baixo, até que ela toque a larva (Figura 1A).
5. Ajuste a posição da larva empurrando suavemente a lamínula para a esquerda ou direita para rolar a larva, de modo que o neurônio / axônio / dendrito de interesse fique na parte superior e mais próximo da lente do microscópio.
6. Para lesão do SNP, monte o lado dorsal da larva para cima, de modo que ambas as traqueias fiquem visíveis. Em seguida, role a larva ~ 30 graus para a esquerda para ferir os axônios do neurônio da classe III da ( Figura 1B e 1C), 90 graus para ferir os axônios do neurônio da classe IV (Figura 1B e 1E) ou ~ 30 graus para ferir dendritos do neurônio da classe IV da ( Figura 2A).
7. Para lesão do SNC, posicione a larva com o lado perfeitamente ventral para cima (Figura 3A), de modo que a região de interesse fique mais próxima da lente do microscópio no plano z.
Lesão por laser de dois fótons
1. Coloque a lâmina com a larva sob o microscópio e prenda-a no lugar com o suporte da lâmina no palco. Use o objetivo 10X (0,3 NA) para encontrar a larva.
2. Adicione 1 gota de óleo de objetiva na lamínula, mude para a objetiva 40X (1.3 NA) e ajuste o foco.
3. Mude para o modo de varredura e reutilize o protocolo experimental 2P GFP 930 Ablation. Certifique-se de que o orifício esteja totalmente aberto.
  OBSERVAÇÃO: A configuração precisa ser otimizada com base em sistemas individuais.
4. Inicie o modo Ao vivo para localizar a região de interesse (ROI) e ajuste as configurações para obter uma boa qualidade de imagem com o zoom apropriado.
  OBSERVAÇÃO: O objetivo desta etapa é encontrar o neurônio / axônio / dendrito para ferir, em vez de obter a imagem de melhor qualidade. Portanto, use as configurações mínimas suficientes para visualizar a área alvo, a fim de evitar superexposição ou fotobranqueamento.
5. Parar a verificação em tempo real, para que o botão Cortar fique disponível. Deixe a imagem estática servir como roteiro. Selecione a função Cortar e ajuste a janela de varredura para focar no alvo a ser ferido.
6. Reduza o ROI para ser o tamanho do local potencial da lesão. Por exemplo, basta cobrir a largura de um axônio ou dendrito, para garantir a precisão da lesão e reduzir os danos aos tecidos vizinhos. Se desejar, amplie o ROI antes de cortar, permitindo uma lesão mais precisa.
7. Abra uma nova janela de imagem. Reduza a velocidade de varredura e aumente a intensidade do laser. Determine o aumento na intensidade do laser com base no sinal de fluorescência do tecido escaneado no modo Live.
8. Normalmente, defina a intensidade do laser de dois fótons a partir de 25% para lesão de SNP e 50-100% para lesão de VNC. Para lesão do axônio do SNP, certifique-se de que a intensidade do laser seja de ~480 mW e o tempo de permanência do pixel seja de 8,19 μs. Para a lesão do axônio VNC, certifique-se de que a intensidade do laser e o tempo de permanência do pixel sejam geralmente 965-1930 mW e 8.19-32.77 μs, respectivamente.
9. Inicie a verificação contínua. Deixe o cursor sobre o botão Contínuo. Fique de olho na imagem e pare a varredura assim que for observado um aumento drástico na fluorescência.
  OBSERVAÇÃO: O aparecimento do pico de fluorescência é devido à autofluorescência no local da lesão.
10. Volte para o modo Ao vivo reutilizando as configurações. Encontre a região de interesse que acabou de ser segmentada ajustando o foco.
  OBSERVAÇÃO: Uma boa indicação de lesão bem-sucedida é o aparecimento de uma pequena cratera, estrutura em forma de anel ou detritos localizados bem no local da lesão.
11. Passe para o próximo neurônio e repita a partir da Etapa 1.3.5, para ferir vários neurônios em um único animal. Ou repita a Etapa 1.3.5 enquanto aumenta gradualmente a potência e/ou reduz a velocidade de varredura se a lesão inicial for insuficiente.
  OBSERVAÇÃO: Caso a potência do laser seja muito alta, uma grande área danificada será visível na imagem de varredura ao vivo pós-lesão. Muitos ferimentos podem causar a morte da larva.
12. Recupere a larva removendo cuidadosamente a lamínula e transferindo a larva lesionada para um novo prato com pasta de fermento. Cave várias cavernas na placa de ágar com fórceps; Como alternativa, faça uma ilha de ágar no prato em vez de usar o prato inteiro, para reduzir a possibilidade de a larva rastejar para fora do prato.
13. Coloque a placa em uma placa de Petri de 60 mm com tecido úmido (embebido em solução de ácido propiônico a 0,5%) e cultive em temperatura ambiente ou 25 °C.
  OBSERVAÇÃO: A larva permanecerá no estágio larval por aproximadamente um dia extra à temperatura ambiente (22 ° C) em comparação com 25 ° C.
Imagem confocal pós-lesão
1. Faça a imagem da larva lesionada nos pontos de tempo desejados, preparando a larva usando o mesmo procedimento de anestesia e montagem da Etapa 1.2 e, em seguida, criando imagens com o laser confocal.
  OBSERVAÇÃO: Imagem da larva 24 h após a lesão (AI) para confirmar a lesão axonal e em 48 h AI (neurônios classe IV da) ou 72 h AI (neurônios classe III da) para avaliar a regeneração.
2. Localize a larva usando a objetiva de 10X e, em seguida, mude para uma objetiva de 25X (0,8 NA). Reutilize o protocolo experimental GFP Imaging.
3. Clique no botão Ao vivo e encontre o mesmo neurônio lesionado anteriormente.
4. Defina a primeira e a última posição Z na janela de varredura ao vivo. Pressione parar e clique em Iniciar experimento para adquirir uma imagem Z-stack.
  OBSERVAÇÃO: Certifique-se de que um ponto de normalização (o ponto de convergência do axônio) seja incluído ao capturar imagens para que a quantificação da regeneração seja possível (Figura 1D, 1F) – isso é discutido mais adiante na seção de análise de dados.
5. Mude para Processamento de imagem, selecione a imagem recém-tirada e gere uma projeção de intensidade máxima. Salve as imagens de projeção de pilha z e intensidade máxima.

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Éter dietílico, reagente ACS, anidro	Acros Orgânicos	AC615080010
Óleo Halocarbon 27	Genesee Científico	Rolamento 59-133
Ácido propiônico	J.T.Baker	U33007
Vidros de cobertura: retângulos	Fisher Científico	12-544-D	50 mm X 22 mm
Microscópio de varredura a laser Zeiss LSM 880	Zeiss
Software Zen	Zeiss
Camaleão Ultra II	coerente

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