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Este protocolo foi extraído de Catrina et al., Visualizando e rastreando mRNAs endógenos em câmaras de ovos de Drosophila melanogaster vivas, J. Vis. Exp. (2019).
1. Projeto de MBs para imagens de células vivas
- Dobre a sequência de RNA alvo para prever a estrutura secundária do alvo de mRNA usando a "forma de RNA" do servidor mfold (http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold/RNA-Folding-Form).
- Cole / carregue a sequência de destino no formato FASTA, selecione 5 ou 10% de sub-otimalidade (estruturas com uma energia livre de dobra dentro de 5 ou 10% do valor MFE, respectivamente) e ajuste o número máximo de dobras calculadas de acordo (por exemplo, maior para 10% de sub-otimização).
OBSERVAÇÃO: A inclusão de estruturas secundárias abaixo do ideal ao projetar MBs permite a identificação de regiões dentro do mRNA alvo que podem ser mais flexíveis ou mais rígidas do que o previsto apenas para a estrutura de energia livre mínima (MFE), o que melhora o design geral de MBs adequados para imagens de células vivas.
- Selecione um "trabalho imediato" para alvos de mRNA de 800 nucleotídeos (nt) ou um "trabalho em lote" para comprimentos de mRNA entre 801 e 8.000 nt. Salve o arquivo "ss-count" como arquivo de texto simples.
- Use o arquivo "ss-count" obtido na etapa 1.1 como entrada para o programa PinMol (https://bratulab.wordpress.com/software/) com os parâmetros desejados, para projetar vários MBs para o alvo de mRNA (consulte os tutoriais que descrevem o uso do programa PinMol em https://bratulab.wordpress.com/tutorial-pinmol-mac/ ).
- Determine a especificidade dos MBs selecionados realizando a análise BLAST: use "blastn" com o banco de dados apropriado (por exemplo, para MBs específicos de mRNA de oskar, use o banco de dados "refseq-rna" e o organismo Drosophila melanogaster).
- Identifique qualquer expressão específica do tecido do alvo de mRNA (por exemplo, para oskar mRNA Flybase> High-Throughput Expression Data> FlyAtlas Anatomy Microarray ou modENCODE Anatomy RNA-Seq; http://flybase.org/reports/FBgn0003015) e compare com quaisquer hits positivos do BLAST. Elimine sondas que mostram >50% de homologia cruzada com outros mRNAs que também são expressos no tecido/célula de interesse.
- Selecione o par de fluoróforo e atenuador apropriado para a configuração de microscopia disponível para realizar imagens de células vivas (por exemplo, Cy5/BHQ2).
2. Síntese, Purificação e Caracterização MB
- Use síntese e purificação internas conforme descrito anteriormente em Bratu, Methods in Molecular Biology (2006), ou serviços de fornecedores comerciais, para sintetizar e purificar de um a cinco MBs (veja a nota acima), usando o seguinte esquema de rotulagem: [5'(Fluoróforo)-(Ligante C3 ou C6)-(sequência 2'-O-metil MB)-(Quencher)3']. Purificar MBs usando HPLC de fase reversa, internamente ou usando os serviços do provedor comercial.
OBSERVAÇÃO: Os fosforamiditos usados para síntese automatizada de sonda devem ter a modificação de ribonucleotídeo 2'-O-metil. Pode-se também usar quimeras de ácido nucleico bloqueado alternado (LNA) e modificações de 2'-O-metil para aumentar a estabilidade de um híbrido entre um MB mais curto e seu mRNA alvo.
- Sintetizar oligonucleotídeos de DNA que correspondam à sequência da região de RNA alvo e, portanto, sejam complementares à região de sonda de MBs, para uso na caracterização in vitro (consulte as etapas 2.3 a 2.5; nota acima). Maximize a hibridização do MB com o mimetizador de alvo de DNA-oligonucleotídeo, incluindo em cada extremidade do alvo de DNA quatro nucleotídeos adicionais, conforme encontrado na sequência de mRNA alvo.
OBSERVAÇÃO: Uma caracterização mais rigorosa da eficiência do MB para detectar a sequência alvo pode ser realizada usando alvos de RNA sintetizados in vitro em vez de oligonucleotídeos de DNA complementares.
- Realize a desnaturação térmica do MB sozinho, meça sua temperatura de fusão (Tm) e confirme se o MB assume a forma desejada de grampo de cabelo na temperatura fisiológica. Observamos valores de Tm entre 60 e 90 °C.
- Realize a desnaturação térmica do MB na presença do alvo de oligonucleotídeo de DNA e meça o Tm do híbrido alvo MB: DNA, conforme descrito anteriormente em Bratu, Methods in Molecular Biology (2006). Um Tm entre 55 e 60 °C é desejado para o híbrido MB:DNA.
- Realizar reações de hibridização in vitro com o alvo de oligonucleotídeo de DNA correspondente e determinar a eficiência da formação do híbrido MB: DNA à temperatura fisiológica, conforme descrito anteriormente em Bratu, Methods in Molecular Biology (2006). A cinética de hibridização rápida com o mimetismo do alvo de DNA é desejada, no entanto, os MBs que não apresentam alta eficiência de hibridização com alvos de DNA podem ter um melhor desempenho com o mRNA alvo in vitro e/ou in vivo.
3. Dissecção e preparação de câmaras de ovos individuais para microinjeção
- Alimente as fêmeas recém-nascidas e acasaladas por 2-3 dias com pasta de fermento fresca.
- Anestesie moscas em uma almofada de CO2 e, usando uma pinça fina (Dumont # 5), transfira 1-2 fêmeas para uma gota de óleo de halocarbono 700 em uma lamínula de vidro.
- Usando uma pinça, oriente a mosca com o lado dorsal para cima sob um estereomicroscópio. Disseque o abdômen feminino fazendo uma pequena incisão na extremidade posterior e aperte suavemente o par de ovários no óleo.
- Explante os ovários em uma gota de óleo em uma nova lamínula. Segure suavemente um ovário com uma pinça enquanto arranca os estágios mais jovens do ovário com a outra pinça. O mRNA do oskar está ativamente localizado no meio da oogênese (estágios > 7), e as câmaras de ovos mais jovens (estágios < 7) são mais difíceis de injetar e não sobrevivem por tanto tempo. Arraste lentamente a lamínula (com um movimento para baixo) até que os ovaríolos individuais ou as câmaras de ovos estejam isolados e alinhados verticalmente. Separe ainda mais as câmaras de ovos individuais, deslocando os estágios indesejados da cadeia de ovos do ovariolo.
OBSERVAÇÃO: Certifique-se de que as câmaras de ovos provocadas individualmente não flutuem no óleo e que adiram à lamínula. Isso é importante tanto para a microinjeção quanto para a aquisição de imagens bem-sucedidas.
4. Microinjeção de MBs nas células enfermeiras das câmaras de ovos
- Prepare a solução MB, usando um farol molecular (por exemplo, osk2216Cy5) ou uma mistura de dois MBs que visam mRNAs diferentes e que são marcados com fluoróforos espectralmente distintos (por exemplo, osk2216Cy5 e drongo1111Cy3). Use uma concentração de 200-300 ng / μL cada MB em HybBuffer (50 mM Tris-HCl - pH 7,5, 1,5 mM MgCl2 e 100 mM NaCl). Para um coquetel de quatro MBs marcados com o mesmo fluoróforo que têm como alvo o mesmo mRNA a 200 ng/μL cada em HybBuffer (por exemplo, osk82, osk1236, osk2216). Gire a solução MB imediatamente antes de carregar a agulha para microinjeção.
- Selecione o objetivo. Uma objetiva de óleo 40x é recomendada para encontrar uma câmara de ovos apropriada e para realizar a microinjeção.
- Monte a lamínula com a câmara de ovos dissecada na platina do microscópio. Levante a objetiva na posição de foco e identifique uma câmara de ovo em um estágio de desenvolvimento intermediário a tardio, que esteja devidamente orientada para microinjeção (ou seja, com o eixo AàP perpendicular à ponta da agulha para permitir uma injeção fácil dentro de uma célula enfermeira proximal ao oócito).
- Carregue uma agulha (comercial ou preparada internamente) com solução de ~ 1 μL MB (consulte a etapa 1.1) e conecte-a ao microinjetor. Para microinjeções em câmaras de ovos de D. melanogaster, oriente a agulha (consulte a Tabela de Materiais) em um ângulo <45° em relação ao estágio do microscópio (por exemplo, 30°) para evitar perfurar várias células enfermeiras.
- Configure o injetor com pressão de injeção de 500-1.000 hPa e pressão de compensação de 100-250 hPa (consulte a Tabela de Materiais).
- Mova lentamente o palco para trazer no campo de visão uma área da gota de óleo sem câmaras de ovos.
- Usando o joystick do micromanipulador, abaixe suavemente a agulha na gota de óleo e coloque sua ponta em foco em direção à periferia do campo de view.
- Execute uma função de 'limpeza' para remover o ar da ponta da agulha e garantir que haja fluxo da agulha.
- Traga a agulha para a posição inicial e concentre-se na câmara do ovo a ser microinjetada, depois coloque a agulha de volta em foco e posicione-a perto da borda da câmara do ovo.
- Realize um ajuste fino da posição Z da objetiva de modo que a membrana que separa as células foliculares das células enfermeiras esteja em foco.
- Insira a agulha em uma célula de enfermagem e execute a injeção por 2-5 s.
- Remova suavemente a agulha e retraia-a para a posição inicial.
- Altere a objetiva para a ampliação desejada para aquisição de imagem (60-63x ou 100x), concentre-se na câmara de ovos e inicie a aquisição.