$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Este protocolo é um trecho de Du et al., Uma estratégia eficiente para gerar sistemas de transcrição binários específicos de tecido em Drosophila por edição de genoma, J. Vis. Exp. (2018).
1. Genética e rastreio de moscas (Figura 1 e Figura 2)
- Quando os embriões injetados se desenvolverem em adultos, cruze cada mosca G0 com moscas balanceadoras. Selecione o balanceador adequado para o cromossomo que contém o alelo alvo.
- Anestesie a prole F1 de cada cruzamento G0 em uma almofada de CO2 e escolha aleatoriamente 10-20 machos sob um estereomicroscópio. Cruze-os individualmente com as fêmeas balanceadoras, conforme mostrado em Figura 2.
- Quando as larvas F2 eclodirem, escolha o único pai F1 de cada cruzamento e extraia o gDNA usando o protocolo de preparação de DNA genômico de mosca única:
- Prepare o tampão de extração de gDNA: 10 mM Tris-Cl pH 8,2, 1 mM EDTA, 25 mM NaCl, armazenar em temperatura ambiente. Prepare 20 mg/ml de solução-mãe de proteinase K e guarde no congelador.
- Coloque cada mosca em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e rotule o tubo. Conservar no congelador a -80 °C durante a noite.
- Preparar um novo volume de trabalho de tampão de extracção de gADN contendo 200 μg/ml de concentração final de proteinase K.
Observação: não use um buffer antigo para esta etapa.
- Esmague cada mosca por 10 a 15 s com uma ponta de pipeta contendo 50 μL de tampão de compressão sem dispensar o líquido. Dispense o tampão restante no tubo e misture bem. Incubar a 37 °C durante 20–30 min.
- Coloque os tubos em um bloco de calor a 95 °C por 1–2 min para inativar a proteinase K.
- Gire para baixo por 5 min a 10.000 x g. Conservar a preparação a 4 °C para posterior análise de PCR.
- Use o mesmo método para preparar o gDNA de uma mosca nos-Cas9, que serve como controle negativo. Execute triagens baseadas em PCR em três etapas para identificar o HDR correto (Figura 1, Figura 3) usando gDNA de cada macho F1 como modelo5. Use 1 μL da preparação de DNA no seguinte sistema de reação de PCR: 10 μL de 2x PCR Master Mix com corante, 1 μL de cada primer (10 μM), 1 μL de molde de DNA e 7 μL de ddH2O.
- Conforme mostrado em Figura 3A, realizar PCR usando os primers fwd1 e rev1 para rastrear a existência da inserção ou substituição; realizar PCR usando primers fwd2 e rev2 para verificar a inserção ou substituição da região 3'; realizar PCR usando primers M13F e rev3 para verificar o HDR "final" (Tabela 1C).
- Mantenha as linhas de mosca com o HDR de fim confirmado e estabeleça estoques equilibrados da geração F2. O cruzamento para o balanceador voa novamente para remover quaisquer mutações não intencionais em outros cromossomos.
