Este protocolo é um trecho de Koon et al., Preparação de Organismos Procarióticos e Eucarióticos Usando Secagem Química para Análise Morfológica em Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV), J. Vis. Exp.(2019).
1. Preparação e Fixação
- Prepare Drosophila melanogaster (mosca da fruta).
- Anestesie moscas adultas usando 100% de dióxido de carbono. Coloque os adultos anestesiados (cerca de 10 a 30 moscas) em um pequeno frasco de plástico com tampa de rosca ou tubo de centrífuga de 1,5 mL.
- Mergulhe as moscas anestesiadas em 1 mL de fixador (glutaraldeído a 1,25%, tampão fosfato 0,1 M pH 7,2) por 2 h (ou durante a noite) a 4 ° C. Se as moscas flutuarem para a superfície do fixador, adicione algumas gotas de éter terc-octilfenílico de polietilenoglicol a 2,5% para enfraquecer a tensão superficial do fixador, permitindo a submersão total do tecido. Remova o fixador usando uma pipeta de vidro.
2. Lavagem e desidratação
- Lave e desidrate a Drosophila melanogaster (mosca da fruta).
- Lave a amostra fixa três vezes com 1 mL de tampão fosfato 0,1 M pH 7,2 à temperatura ambiente por 10 min em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Retire cada lavagem com uma pipeta de vidro, tomando cuidado para não remover as moscas.
- Desidratar a amostra usando uma série graduada de etanol, por 10 min em um volume de 1 mL em um tubo de microcentrífuga. As concentrações de etanol são: 25%, 50%, 75%, 80%, 95%, 100%. Retire o etanol com uma pipeta de vidro, tomando cuidado para não retirar as moscas.
- Guarde a amostra no tubo de microcentrífuga de 1,5 mL com etanol 100% suficiente para cobrir a amostra antes de secar.
3. Secagem
- Realize a secagem química usando hexametildisilazana (HMDS).
- Substitua a solução de etanol 100% por uma solução 1:2 de HMDS e etanol 100% por 20 min. Substitua a solução 1:2 por uma solução 2:1 de HMDS e etanol 100% por 20 min. Substitua a solução 2:1 por HMDS 100% por 20 min. Repita uma vez.
Nota: HMDS é inflamável e uma toxina aguda (via dérmica). O HMDS deve ser manuseado em uma capela de exaustão química usando equipamento de proteção individual apropriado, incluindo luvas, jaleco e proteção para os olhos.
- Transfira a amostra em HMDS, se estiver em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL, para um prato de pesagem de alumínio descartável. Uma vez no prato de pesagem de alumínio, substitua o HMDS 100% por HMDS 100% fresco apenas o suficiente para cobrir a amostra.
- Transfira a amostra para um dessecador sem vácuo de plástico ou vidro com dessecante fresco (5-6 cm de profundidade) e coloque em uma capela de exaustão química. Como alternativa, coloque a amostra diretamente em uma capela de exaustão química para secar com uma tampa solta, como uma caixa, para evitar que detritos caiam sobre a amostra. Deixe a amostra secar por 12 a 24 h.
4. Montagem
- Monte Drosophila melanogaster (mosca da fruta).
- Rotule a parte inferior do stub de montagem de alumínio para indicar o que está sendo colocado no topo.
Coloque as moscas secas na posição desejada em adesivo ou aba adesiva de carbono presa ao topo de um toco sob um microscópio de dissecação com pinças de precisão.
- Aplique adesivo condutor de prata, ou seja, tinta prateada, ao redor das bordas externas dos tocos. Conecte a tinta prateada às moscas usando um palito para garantir a condutividade. Não permita que a tinta toque na área de imagem desejada.
- Coloque os tocos em uma caixa de suporte de cano e coloque a caixa de suporte de cano aberta em um dessecador. Deixe a tinta prateada secar pelo menos 3 h ou durante a noite para obter melhores resultados.
