Este protocolo é um trecho de Nazario-Toole e Wu, Avaliando a resposta imune celular da mosca da fruta, Drosophila melanogaster, usando um ensaio de fagocitose in vivo, J. Vis. Exp. (2019).
1. Prepare as partículas de fluoresceína para injeção
- Reconstitua 10 mg de partículas de bactérias mortas pelo calor disponíveis comercialmente marcadas com fluoresceína (consulte a Tabela de Materiais) para uma concentração estoque de 10 mg / mL adicionando 990 μL de 1x PBS estéril e 10 μL de azida sódica 50 mM. Vórtice para misturar.
- Divida em alíquotas de 8 μL de uso único em tubos de 0,2 mL e armazene em uma caixa escura a 4 °C para minimizar a sensibilidade associada à luz.
OBSERVAÇÃO: O conservante azida de sódio é opcional e pode ser omitido se os estoques de 10 mg/mL forem feitos com 1 mL estéril 1x PBS, alíquotas e armazenados a -20 °C.
- Faça uma solução de 10 mL de corante alimentar a 5% em 1x PBS misturando 500 μL de corante alimentar verde filtrado por seringa e 9,5 mL de 1x PBS estéril.
- Lave as partículas antes da injeção para remover a azida de sódio. Misture 42 μL de PBS estéril 1x e 8 μL de 10 mg / mL em um tubo de 1,7 mL. Centrifugue na velocidade máxima por 2,5 min em temperatura ambiente.
- Remova o sobrenadante, adicione 50 μL 1x PBS e centrifugue na velocidade máxima por 2,5 min em temperatura ambiente.
- Repita as etapas 1.3 e 1.3.1 2x, para um total de 3 lavagens.
- Após a lavagem final, descarte o sobrenadante e ressuspenda as partículas a 1,6 mg / mL em 50 μL de corante alimentar a 5% em 1x PBS.
- Enrole o tubo em papel alumínio para proteger da luz. Conservar a 4 °C, eliminar após 1 semana.
2. Preparar a estação de injecção e as moscas
- Prepare a almofada de injeção. Para injetar até 4 genótipos de moscas ao mesmo tempo, use fita adesiva de laboratório para dividir uma almofada retangular de CO2 em 4 seções. Na bancada perto do microscópio, designe áreas para colocar os frascos depois que as moscas estiverem alinhadas na almofada (uma para cada canto da almofada).
- Prepare frascos para injetáveis de moscas de 4 a 7 dias de idade, com idade correspondente, para injeção. Para cada estirpe a testar, transferir 5 machos e 5 fêmeas para um frasco fresco e rotulado com alimentos preparados para moscas e conservar a 25 °C.
- Prepare o injetor pneumático (consulte a Tabela de Materiais) ajustando o instrumento para um modo TIMED de 100 ms (rajadas curtas de pressão de gás para expelir o líquido - permitindo a entrega de volumes sub-nanolitros).
- Prepare as lâminas do microscópio. Corte tiras de fita isolante de 1,5 polegada, dobre em um laço com o lado adesivo para fora e coloque em uma lâmina de microscópio rotulada.
3. Prepare agulhas capilares de vidro
- Puxe agulhas de vidro (capilares de vidro de parede fina) usando um extrator de agulha.
- Segure a agulha sob o microscópio com um micrômetro e quebre a ponta usando uma pinça de aço inoxidável de ponta fina #5. Pontas de 100 μm são suficientes para perfurar a cutícula da mosca, minimizando ferimentos.
- Meça o volume de líquido que será injetado em cada mosca. Carregue a agulha com corante alimentar estéril a 5% em 1x PBS e expulse o líquido sobre uma gota de óleo mineral em um micrômetro de 0,01 mm.
OBSERVAÇÃO: Se a gota de líquido for esférica, o volume em picolitros é calculado como (tamanho)3/1910. Uma agulha com um diâmetro de 100 μm ejetará ~2 nL em 100 ms.
4. Injetar moscas
- Pipete 10 μL de partículas de 1,6 mg / mL em um pequeno quadrado de parafilme.
- Puxe o líquido para dentro da agulha e monte no bico injetor (consulte a Tabela de Materiais).
- Anestesiar moscas com CO2 e alinhá-las em sua área designada no flypad, com o lado ventral para cima e as cabeças orientadas para a frente da almofada. Coloque os frascos nas áreas correspondentes na bancada.
- Injete moscas no canto superior do abdômen com bombas de líquido de 5.100 ms (~ 10 nL no total).
- Transfira as moscas injetadas para os frascos apropriados, anote o tempo no frasco. Conservar a 25 °C.
- Carregue uma nova agulha com 0,4% de solução de azul de tripano.
- Defina o injetor pneumático para GATED, o que permite um fluxo constante de ar para empurrar o líquido para fora da agulha.
- Anestesiar as moscas depois de terem descansado por 30 min e injetar com Trypan Blue até que o abdômen esteja cheio e distendido.
OBSERVAÇÃO: Ao examinar a maturação do fagossomo com partículas marcadas com um corante sensível ao pH, deixe as moscas descansarem por 1 h e não injete azul de tripano antes de montar as moscas.
- Monte moscas em lâminas de microscópio com fita isolante, com o lado ventral voltado para baixo. Empurre as asas para o lado da braguilha e prenda-as na fita. Além disso, empurre suavemente a cabeça para dentro da fita para garantir que a mosca não se mova.
