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Este protocolo é um trecho de Bantel e Tessier, Ensaio de Preferência de Sabor para Drosophila Adulta, J. Vis. Exp. (2016).
1. Fome
- Prepare frascos de fome de moscas saturando uma bola de algodão com 18,2 MΩ de água no fundo de um frasco padrão para moscas. Alternativamente, sature da mesma forma uma pequena tira de papel de filtro com 18,2 MΩ de água e coloque em ângulo dentro do frasco.
- Colete moscas em conjuntos de ~ 100 animais em uma almofada de CO2 e, em seguida, adicione as moscas a um frasco preparado.
OBSERVAÇÃO: Os melhores resultados são obtidos com animais com menos de 5 dias de idade. No entanto, a idade exata dos animais pode ser controlada como uma variável experimental para determinar mudanças na preferência de sabor ao longo do tempo.
- Use uma bola de algodão ou rolha de espuma para fechar os frascos. Coloque os frascos de lado em uma incubadora ambientalmente controlada. Mantenha a temperatura em 25 °C e a umidade acima de 70%. Deixe os frascos intocados por 24 horas.
2. Ensaio de Preferência de Sabor
- Prepare todos os provantes para o ensaio no mesmo dia do teste.
OBSERVAÇÃO: Os saborizantes exatos a serem usados variam de acordo com a pergunta experimental que está sendo feita. A seguir estão exemplos de saborizantes usados neste protocolo. Consulte a seção 4 para obter otimizações.
- Prepare o saborizante de controle (1 mM de sacarose) combinando 10 μl de solução de sacarose 100 mM, 13 μl de corante alimentar vermelho e 977 μl de 18,2 MΩ de água.
- Prepare o saborizante experimental (5 mM de sacarose) combinando 50 μl de solução de sacarose 100 mM, 10 μl de corante alimentar azul e 940 μl de 18,2 MΩ de água.
- Fazer câmaras de ensaio utilizando uma placa de Petri de plástico padrão de 100 mm x 15 mm, preparada do seguinte modo:
- Coloque três gotas de 10 μl de saborizante de controle mais próximo da borda do prato às 12 horas e outras 3 gotas às 6 horas. Certifique-se de que o espaçamento entre as gotas seja semelhante.
- Colocar três gotas de 10 μl de provizante experimental mais próximo do bordo da placa às 3 horas e outras 3 gotas às 9 horas. Certifique-se de que o espaçamento entre as gotas seja semelhante.
- Repita as etapas 2.2.1 e 2.2.2 para quantas réplicas desejar.
- Esvazie 1 frasco de ~ 100 moscas famintas em uma almofada de CO2 apenas o tempo suficiente para anestesiar todos os animais (aproximadamente 10 segundos). Pincele os animais no meio de uma câmara de ensaio preparada e cubra com a tampa do prato.
OBSERVAÇÃO: Períodos mais longos de exposição ao CO2 devem ser evitados para melhorar o tempo de recuperação e limitar a interferência no comportamento alimentar. A exposição ao gelo (~ 5 min) pode ser usada para anestesiar para evitar efeitos comportamentais de CO2 que podem surgir até mesmo de uma exposição limitada.
- Coloque a câmara de ensaio em uma caixa de papelão opaca. Certifique-se de rotular a parte externa da caixa com a condição e o genótipo que estão sendo testados.
- Coloque toda a configuração (câmara de ensaio contida na caixa de papelão da etapa 2.4) em uma incubadora de 25 ° C com pelo menos 70% de umidade por 2 horas.
- Repita as etapas 2.3 a 2.5 para todas as replicações.
- Após 2 horas, colocar as câmaras de ensaio, ainda contidas em caixas de cartão, directamente num congelador a -20 °C até estarem prontas para a quantificação.
3. Quantificação do ensaio de preferência de sabor
- Deixe uma única câmara de ensaio aquecer até a temperatura ambiente (aproximadamente 5 min).
- Sob um microscópio de dissecação, usando uma escova ou fórceps, agrupe os animais com base na cor de seu abdômen: vermelho, azul, roxo ou claro (Figura 1).
- Registar o número de animais em cada agrupamento. Considere que os animais claros não participaram do ensaio e, portanto, não os inclua em nenhum cálculo.
- Calcular o índice de preferência de acordo com uma das seguintes equações:
- Se o saborizante experimental de interesse for adicionado ao corante vermelho, use (Nvermelho + 0,5Nroxo) / (Nvermelho + Nazul + Nroxo).
- Se o saborizante experimental for adicionado ao corante azul, ajuste a equação para (Nazul + 0,5Nroxo) / (Nazul + Nvermelho + Nroxo).
- Repetir os cálculos para todas as condições experimentais e replicados.
4. Otimização do ensaio de preferência de sabor
- Determinar empiricamente a concentração de indicadores de corantes alimentares a serem usados para que o corante alimentar não afete o resultado do ensaio de sabor, da seguinte forma:
- Prepare 4 saborizantes usando o mesmo composto base (por exemplo, 5 mM de sacarose) conforme indicado na etapa 2.1, mas omita o corante alimentar.
- Adicione 1,3% de corante alimentar vermelho a um dos saborizantes. Faça os 3 saborizantes restantes com corante alimentar azul de concentrações variadas em cada tubo (por exemplo, 0,6%, 1% e 1,3%).
- Conclua as etapas 2.2 a 3.4 do protocolo para cada par de saborizantes: 1,3% vermelho vs. 0,6% azul; 1,3% vermelho vs. 1% azul e 1,3% vermelho vs. 1,3% azul.
- Repita as etapas 4.1.1-4.1.3 com diferentes porcentagens de corante alimentar azul até que o índice de preferência obtenha um valor médio de 0 (Figura 2).
OBSERVAÇÃO: Como ponto de partida, 1,3% de corante alimentar vermelho juntamente com 1% de corante alimentar azul normalmente produz bons resultados. Se nenhuma concentração satisfatória de corante alimentar azul puder ser combinada com corante a 1,3%, as etapas 4.1.1 a 4.1.3 podem ser repetidas com concentrações variadas de corante vermelho e uma concentração constante de corante alimentício azul.
- Analise todas as condições a serem testadas com as mesmas concentrações otimizadas de corantes alimentares.
