O ensaio CApillary FEeder (CAFE): um método para rastrear o consumo e a preferência alimentar em Drosophila

Resumo

Fonte: Diegelmann, S., et al. O ensaio CApillary FEeder mede a ingestão de alimentos em Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (2017).

Este vídeo descreve o ensaio CApillary FEeder, ou CAFE, um método comportamental que mede a ingestão de alimentos e a preferência de moscas-das-frutas desenfreadas. O protocolo apresentado mostra como realizar o ensaio com evaporação mínima dos capilares cheios de líquido usados para fornecer o alimento e rastrear sua ingestão.

Protocolo

Este protocolo é um trecho de Diegelmann et al., O ensaio capilar FEeder mede a ingestão de alimentos em Drosophila melanogaster, J. Vis. Exp. (2017).

1. Montagem e execução do ensaio de FEeder capilar

1. Se não for necessário jejuar, transferir as moscas experimentais para o ensaio por batida ou por maçarico. Certifique-se de incluir três frascos de controle sem moscas para quantificar a evaporação.
2. Remova cuidadosamente uma ponta de pipeta (volume de 2 a 20 μL) que está fechando uma das aberturas externas e insira primeiro um capilar de vidro cheio, na extremidade inferior. Prenda o capilar colocando a ponta da pipeta de volta ao lado do capilar. Se várias soluções alimentares estiverem sendo testadas, repita este procedimento de acordo.
3. Coloque as extremidades capilares dentro de todos os frascos para injetáveis no mesmo nível para evitar vieses que podem ocorrer se as fontes de alimento estiverem localizadas em alturas diferentes (3 - 4 cm da tampa); mantenha uma distância do papel de filtro para evitar que o capilar vaze ao tocar acidentalmente no papel de filtro ou em diferentes viscosidades das fontes de alimentos.
4. Rotule a extremidade superior do líquido colorido usando uma caneta marcadora (marque_{o início}). Para garantir que os diferentes capilares possam ser identificados, rotule-os individualmente usando um código de cor ou listra.
5. Coloque vários ensaios CAFE preparados dentro de uma caixa plástica com incrustação quadriculada e transfira a caixa (Figura 2A) para uma posição segura em condições de laboratório ou em uma câmara climática com temperatura controlada, luz e umidade (parâmetros: 25 °C, 60% de umidade relativa, ciclo claro-escuro de 12 h/12 h) durante o período experimental (por exemplo, 3 h ou dias).
6. À medida que o papel de filtro inferior seca se o ensaio for realizado durante vários dias, aplique água fresca a cada 24 h através do tampão de esponja (100 μL) para manter a umidade constante dentro do ensaio. Use quatro frascos separados (8 cm de altura, 3,3 cm de diâmetro) cheios de 30 mL ddH₂O como dispositivos de umidade e coloque-os ao lado dos ensaios CAFE na caixa de plástico. Use uma tampa para a caixa plástica para criar um ambiente com umidade controlada durante o experimento (Figura 2A).
   OBSERVAÇÃO: Uma variabilidade mais ampla ocorre em condições de laboratório; no entanto, é viável realizar o ensaio CAFE em temperatura ambiente (por exemplo, em uma sala de aula). O uso de um dispositivo de umidificação (papel de filtro, com ou sem tampão de esponja úmida, frascos de água cheios e tampa para a caixa de plástico) é altamente encorajado para diminuir a evaporação (Figura 2B).
7. Substituir os capilares por outros recém-enchidos para experiências a longo prazo de 24 em 24 horas. Anotar as moscas mortas antes de cada intervalo de 24 horas e utilizar o número de moscas vivas para calcular o consumo por mosca para o período seguinte. Descarte os capilares antigos após medir o declínio do menisco (ver 2.1).
   OBSERVAÇÃO: Durante um experimento de 3 horas, quase não vemos moscas mortas. Durante um estudo de 4 dias, geralmente encontramos de 1 a 3 moscas mortas.
8. No final do ensaio ou antes de substituir o capilar, marque o menisco inferior do capilar (_{extremidade da marca}) com uma caneta marcadora enquanto o ensaio CAFE ainda está na posição vertical. Descarte os dados se o_final da marca não estiver abaixo da marca inicial (_início da marca). Não remova a tampa, pois isso pode alterar o menisco.
9. Remova cuidadosamente os capilares do ensaio e armazene-os para coleta de dados. Verifique se o líquido dentro do capilar atingiu a extremidade inferior, caso contrário, descarte os dados, pois o alimento não era acessível às moscas. Colete todos os capilares por frasco para injetáveis como um grupo. Insira as pontas da pipeta não cortadas em todas as aberturas para evitar que as moscas escapem. Desmonte a configuração e lave os frascos, tampas e tampões de esponja em banho de sabão e seque durante a noite em temperatura ambiente para uso posterior.
   OBSERVAÇÃO: As moscas podem ser analisadas posteriormente após o ensaio. Confirme a ingestão de alimentos a olho nu ou sob um microscópio de dissecação.
10. Repita experimentos com os mesmos genótipos em pelo menos três dias diferentes.

2. Coleta e análise de dados

1. Meça a distância entre o_início e o_fim da marca no capilar usando um paquímetro ou uma régua. Para transferir dados diretamente para uma planilha, use um paquímetro digital conectado por USB (Universal Serial Bus) (Figura 1E). Descarte os capilares após a medição.
2. Considere o tamanho capilar para calcular a absorção ou evaporação dos alimentos. Por exemplo, considere um capilar com 73 mm de comprimento e 5 μL de solução alimentar. Uma diminuição de 14,6 mm no menisco reflete a captação de 1 μL de solução. Calcule a ingestão de alimentos usando a seguinte fórmula:
   Ingestão de alimentos (μL) = distância medida (mm)/ 14,6 mm
3. Para excluir o efeito da evaporação na ingestão de alimentos, calcule a evaporação média nos três frascos de controle (no mínimo) sem moscas. Subtraia esse valor médio do valor obtido para o consumo alimentar pelas moscas.
4. Use a seguinte fórmula para determinar o consumo total por mosca:
   Consumo de alimentos (μL) = (Absorção de alimentos [μL] - Perda por evaporação [μL])/número total de moscas no frasco. Para experimentos de longo prazo, use o número de moscas vivas antes do início do intervalo de 24 horas.
5. Para levar em conta as diferenças no tamanho corporal, como entre moscas machos e fêmeas, normalize o consumo de alimentos para o peso corporal (μL de alimento / mg de mosca).
6. Use software estatístico para análise de dados. Para dados normalmente distribuídos, use testes T de Student para determinar as diferenças entre dois grupos de moscas e use ANOVA (análise de variância) com testes post hoc de Tukey Cramer para mais de dois grupos. Em uma situação de escolha, analise as diferenças da escolha aleatória usando um teste de sinal não paramétrico de uma amostra.

Resultados

Figura 1: O ensaio de Drosophila melanogaster CApillary FEeder. A) O ensaio de alimentação com moscas. O papel de filtro umedecido fornece água no fundo do frasco. Quatro capilares são fornecidos durante o experimento (alimentos de cor vermelha e azul em capilares opostos). Observe que os capilares são fixados na posição por uma segunda ponta de pipeta e as posições não utilizadas são fechadas u...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Frascos (reprodução)	Greiner Bio-One	960177	www.greinerbioone.com
Frascos para injetáveis (ensaio CAFE)	Greiner Bio-One	217101	www.greinerbioone.com
Ensaio Lid-CAFE	oficina	–	–
Caixa de plástico, parede baixa	Passatempo	353	www.plastime.it
Tampa para a caixa de plástico	oficina	–	–
Capilares	BLAUBRAND	REFERÊNCIA 7087 07	www.brand.de
Pontas de pipeta	Greiner Bio-One	Rolamento 771290	www.greinerbioone.com
Círculos de papel de filtro	O que homem	10 311 804	www.sigmaaldrich.com
D(+)-Sacarose	Aplicação	57-50-1	www.applichem.com
Etanol absoluto	Produtos químicos da VWR	20.821.330	www.vwr.com
Corante alimentar (vermelho, E124)	Diversão de fundo	Rolamento 10027	www.backfun.de
Corante alimentar (azul, E133)	Diversão de fundo	10030	www.backfun.de
Solução de sabão (CVK 8)	CVH	Rolamento 103220	www.cvh.de
Paquímetro digital	GARANT	412.616	www.hoffmann-group.com
Frascos (reprodução)			Altura 9,8 cm, diâmetro 4,8 cm
Frascos para injetáveis (ensaio CAFE)			Altura 8 cm, diâmetro 3,3 cm
Ensaio Lid-CAFE			Produzido em oficina universitária, desenho técnico fornecido Clique aqui para baixar este arquivo.
Caixa de plástico, parede baixa			Uma grade de plástico foi feita sob medida para 8 x 10 posições de frascos
Tampa para a caixa de plástico			Dimensões (37 x 29 x 18 cm)
Capilares			Norma DIN ISO 7550, diretriz IVD 98/79 EG, extremidades polidas
Pontas de pipeta			As pipetas para o círculo externo são cortadas de acordo com a tampa
Círculos de papel de filtro			45 mm de diâmetro funciona bem se dobrado para os frascos usados
D(+)-Sacarose			Não prejudicial
Etanol absoluto			Líquido e vapor altamente inflamáveis
Corante alimentar (vermelho, E124)			Não declarado
Corante alimentar (azul, E133)			Não declarado
Solução de sabão (CVK 8)			Sabonete neutro de odor
Paquímetro digital
Comida padrão para moscas			(para 20 L)
Ágar			160 gramas
Levedura de cerveja			299,33 gramas
fubá			1.200 gramas
melaço			1,6 L
Ácido propiônico			57,3 ml
Nipagin 30%			160 mL