CApillary FEeder (CAFE) Analyse: En metode for å spore matforbruk og preferanse i Drosophila

Overview

Denne videoen beskriver CApillary FEeder, eller CAFE, analyse, en atferdsmetode som måler matinntak og preferanse for uhemmet fruktfluer. Den omtalte protokollen viser hvordan man utfører analysen med minimal fordampning fra de væskefylte kapillærene som brukes til å levere maten og spore inntaket.

Protocol

Denne protokollen er et utdrag fra Diegelmann et al., The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster, J. Vis. Exp. (2017).

1. Montering og utførelse av CApillary FEeder Assay

1. Hvis faste ikke er nødvendig, overfør eksperimentelle fluer til analysen ved å trykke eller med blåserør. Pass på å inkludere tre kontroll hetteglass uten fluer for å kvantifisere fordampning.
2. Fjern forsiktig en pipettespiss (2 - 20 μL volum) som lukker en av de ytre åpningene, og sett inn en fylt glasskapillær, nederste ende først. Fest kapillæren ved å plassere pipettespissen tilbake ved siden av kapillæren. Hvis flere matløsninger testes, gjentar du denne prosedyren deretter.
3. Plasser kapillærendene inne i alle hetteglassene på samme nivå for å unngå skjevheter som kan oppstå hvis matkildene var plassert i forskjellige høyder (3 - 4 cm fra lokket); holde avstand til filterpapiret for å forhindre at kapillæren lekker ved et uhell å berøre filterpapiret eller forskjellige viskositeter i matkilder.
4. Merk den øvre enden av den fargede væsken ved hjelp av en markørpenn (marker_{som begynner}). For å sikre at de forskjellige kapillærene kan identifiseres, merker du dem individuelt ved hjelp av en farge- eller stripekode.
5. Plasser flere tilberedte CAFE-analyser inne i en plastboks med rutenettinnlegg og overfør esken (figur 2A) til en sikker posisjon under laboratorieforhold eller i et temperatur-, lys- og fuktighetskontrollert klimakammer (parametere: 25 °C, 60 % relativ luftfuktighet, 12 t/12 t lys-mørk syklus) for den eksperimentelle perioden (f.eks. 3 timer eller dager).
6. Når bunnfilterpapiret tørker ut hvis analysen utføres over flere dager, påfør ferskvann hver 24. Bruk fire separate hetteglass (8 cm høyde, 3,3 cm diameter) fylt med 30 ml ddH₂O som fuktighetsanordninger og plasser dem ved siden av CAFE-analysene i plastboksen. Bruk et deksel til plastboksen for å skape fuktighetskontrollerte omgivelser under eksperimentet (Figur 2A).
   MERK: Bredere variasjon skjer under laboratorieforhold; Det er imidlertid mulig å utføre CAFE-analysen ved romtemperatur(f.eks.i et klasserom). Bruk av en fuktingsenhet (filterpapir, med eller uten våt svamp, fylte vannflasker og deksel til plastboksen) oppfordres på det sterkeste til å redusere fordampning (Figur 2B).
7. Bytt kapillærene med nyfylte for langsiktige eksperimenter hver 24. Legg merke til døde fluer før hvert 24 h intervall og bruk antall levende fluer for å beregne forbruk per flue for følgende periode. Kast de gamle kapillærene etter å ha målt nedgangen i menisken (se 2.1).
   MERK: I løpet av et eksperiment på 3 timer ser vi knapt noen døde fluer. I løpet av en 4 dagers studie finner vi vanligvis 1 - 3 døde fluer.
8. På slutten av analysen eller før du bytter kapillæren, markerer du den nedre menisken til kapillæren_(merketden) med en markørpenn mens CAFE-analysen fortsatt er i oppreist stilling. Forkast dataene hvis_merkeslutt ikke er under det opprinnelige merket (marker_{som begynnelsen}). Ikke fjern lokket, da dette kan endre menisken.
9. Fjern kapillærene forsiktig fra analysen og lagre dem for datainnsamling. Sjekk om væsken inne i kapillæren nådde den nedre enden hvis ikke kast dataene, da maten ikke var tilgjengelig for fluene. Samle alle kapillærer per hetteglass som gruppe. Sett inn uklippede pipettespisser i alle åpninger for å hindre at fluer rømmer. Demonter oppsettet og vask hetteglassene, lokkene og svampbollene i et såpebad og tørk over natten ved romtemperatur for videre bruk.
   MERK: Fluer kan analyseres videre etter analysen. Bekreft matopptaket med øye eller under et disseksjonsmikroskop.
10. Gjenta eksperimenter med samme genotyper på minst tre forskjellige dager.

2. Datainnsamling og analyse

1. Mål avstanden mellom_{markens begynnelse} og_slutten på kapillæren ved hjelp av en kaliper eller en linjal. Hvis du vil overføre data direkte til et regneark, bruker du en USB -fil (Universal Serial Bus) tilkoblet digitalt kaliper (Figur 1E). Kast kapillærene etter målingen.
2. Gjør rede for kapillærstørrelse for å beregne matopptak eller fordampning. Tenk for eksempel på en kapillær som er 73 mm lang og inneholder 5 μL matoppløsning. En 14,6 mm reduksjon i menisken reflekterer opptaket av 1 μL løsning. Beregn matopptak ved hjelp av følgende formel:
   Matopptak (μL) = målt avstand (mm)/ 14,6 mm
3. For å utelukke effekten av fordampning på matinntaket, beregn gjennomsnittlig fordampning i de tre (minst) kontroll hetteglassene uten fluer. Trekk denne gjennomsnittsverdien fra verdien som er oppnådd for matforbruk av fluene.
4. Bruk følgende formel til å bestemme totalt forbruk per flue:
   Matforbruk (μL) = (Matopptak [μL] - Fordampningstap [μL])/totalt antall fluer i hetteglasset. For langsiktige eksperimenter bruk antall fluer i live før starten av 24 h intervallet.
5. For å gjøre rede for forskjeller i kroppsstørrelse, som mellom mannlige og kvinnelige fluer, normaliser matforbruket til kroppsvekt (μL mat / mg fly).
6. Bruk statistisk programvare for dataanalyse. For normalt distribuerte data, bruk studentens T-testerfor å bestemme forskjeller mellom to flygrupper, og bruk ANOVA (variansanalyse) med post hoc Tukey Cramer-tester for mer enn to grupper. I en valgsituasjon analyserer du forskjeller fra tilfeldig valg ved hjelp av en ikke-parametrisk skilttest med ett utvalg.

Representative Results

Figur 1: Drosophila melanogaster CApillary FEeder Assay. A) Fôringsanalysen med fluer. Fuktet filterpapir gir vann på bunnen av hetteglasset. Fire kapillærer er gitt under eksperimentet (rød- og blåfarget mat i motsatte kapillærer). Vær oppmerksom på at kapillærene er festet på plass med en ekstra pipettespiss, og ubrukte posisjoner lukkes ved hjelp av pipettespisser. En skumplugg i midten av lokket tillater luftutveksling. B) Detaljert visning av lokket. Klipp pipettespisser (2 - 20 μL, røde grenser) settes inn i de koniske åpningene i ubrukte posisjoner, og en annen pipettespiss settes inn i kuttspissen for å lukke hullet. De kuttede pipettespissene brukes til å kontrollere plasseringen av mikrokapillærene, og uklippede spisser brukes til å holde kapillærene tett. C) En D. melanogaster fly feeds på en kapillær. D) Etter fôring er matfargen tydelig synlig i flylivet. E) En digital kaliper brukes til å måle avstanden mellom_begynnelse og markere_slutten av menisken. Dataene overføres direkte til et Excel-regneark via USB. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 2: Påvirkning av fordampning i kapillærmateranalysen. A) Flere CAFE-analyser plassert inne i en plastboks med et rutenettinnlegg. For å kontrollere fuktigheten under eksperimentet plasseres fire vannfylte hetteglass (røde felger) inne i gitteret. Fordampningskontrollene er plassert i direkte nærhet til disse hetteglassene. Et deksel for hele oppsettet vises i bakgrunnen. B) Sammenligning av volumtapet gjennom fordampning. Gjennomsnittsverdien for fordampning over 4 dager vises. Fuktighet styres av (i) påføring av vann på den sentrale svampen bung (24 h intervall); (ii) legge til fire vannfylte hetteglass i gitteret; og (iii) ved hjelp av et plastdeksel for hele oppsettet. Fordampning er betydelig lavere hvis fuktighet styres for begge løsningene testet (***P ≤ 0,001; N = 48). Ingen forskjeller i volatilitet mellom EtOH som inneholder og ikke-inneholdende sukroseløsning kan påvises med fuktighetsanordningene som brukes. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vials (breeding)	Greiner Bio-One	960177	www.greinerbioone.com
Vials (CAFE assay)	Greiner Bio-One	217101	www.greinerbioone.com
Lid-CAFE assay	Workshop	–	–
Plastic box, low wall	Plastime	353	www.plastime.it
Cover for the plastic box	Workshop	–	–
Capillaries	BLAUBRAND	REF 7087 07	www.brand.de
Pipette tips	Greiner Bio-One	771290	www.greinerbioone.com
Filter paper circles	Whatman	10 311 804	www.sigmaaldrich.com
D(+)-Sucrose	AppliChem	57-50-1	www.applichem.com
Ethanol absolute	VWR Chemicals	20,821,330	www.vwr.com
Food color (red, E124)	Backfun	10027	www.backfun.de
Food color (blue, E133)	Backfun	10030	www.backfun.de
Soap solution (CVK 8)	CVH	103220	www.cvh.de
Digital caliper	GARANT	412,616	www.hoffmann-group.com
Vials (breeding)			Height 9.8 cm, diameter 4.8 cm
Vials (CAFE assay)			Height 8 cm, diameter 3.3 cm
Lid-CAFE assay			Produced in university workshop, technical drawing supplied Please click here to download this file.
Plastic box, low wall			A plastic grid inlay was custom-made for 8 x 10 vial positions
Cover for the plastic box			Dimensions (37 x 29 x 18 cm)
Capillaries			DIN ISO 7550 norm, IVD-guideline 98/79 EG, ends polished
Pipette tips			Pipettes for the outer circle are cut according to the lid
Filter paper circles			45 mm diameter works nicely if folded for the vials used
D(+)-Sucrose			Not harmful
Ethanol absolute			Highly flammable liquid and vapor
Food color (red, E124)			Not stated
Food color (blue, E133)			Not stated
Soap solution (CVK 8)			Odor neutral soap
Digital caliper
Standard fly food			(for 20 L)
Agar			160 g
Brewer's Yeast			299.33 g
Cornmeal			1,200 g
Molasses			1.6 L
Propionic acid			57.3 mL
Nipagin 30%			160 mL