Este protocolo é um trecho de Tenenbaum e Gavis, Remoção de Tecido Muscular de Drosophila de Filetes Larvais para Análise de Imunofluorescência de Neurônios Sensoriais e Células Epidérmicas, J. Vis. Exp.(2016).
NOTA: O procedimento de remoção muscular (Figura 1) é uma modificação dos métodos descritos anteriormente para a preparação de filetes larvais. As etapas que precedem e seguem a remoção muscular são descritas brevemente e o leitor é encaminhado para trabalhos anteriores em Brent, et al., J. Vis. Exp. (2009) e Karim e Moore, J. Vis. Exp. (2011) para descrições mais detalhadas.
1. Dissecar a larva em solução salina fria
- Prepare uma diluição de trabalho de solução salina HL3.1 fria ou solução salina HL3.1 livre de Ca2+ fria (Tabela 1). Coloque a larva em uma placa de elastômero de silicone com soro fisiológico frio apenas o suficiente para cobrir o fundo da placa.
OBSERVAÇÃO: Recomendamos experimentar o uso de solução salina HL3.1 livre de Ca2+ versus solução salina HL3.1 padrão durante a dissecção larval. Na ausência de cálcio, as contrações dos músculos larvais são bastante reduzidas. Assim, os filés larvais podem ser mais fáceis de manipular quando dissecados em solução salina HL2.1 livre de Ca2+. No entanto, descobrimos que a contração muscular cria espaço entre o músculo e a epiderme e isso pode facilitar a inserção de pinças entre esses tecidos, minimizando o risco de danos à epiderme. Como resultado, o HL3.1 padrão pode ser preferível para preservar a integridade da epiderme e dos neurônios da. Obtemos bons resultados com solução salina e a escolha é deixada para o usuário.
- Posicione a larva com o lado ventral para cima. A superfície ventral da larva pode ser identificada pelas cinturas dentárias abdominais e o lado dorsal pelos tubos traqueais larvais primários que vão de anterior para posterior. Estique a larva na direção ântero-posterior e prenda a cabeça e a cauda em uma placa de dissecação de elastômero de silicone usando alfinetes de insetos. Use uma tesoura de dissecação fina para cortar ao longo da linha média ventral, começando em uma extremidade e progredindo em direção à outra.
OBSERVAÇÃO: Essa orientação preserva o aglomerado dorsal comumente estudado de neurônios da.
- Depois que a larva for aberta, prenda os quatro cantos no prato de dissecação como se estivesse abrindo um livro. Use uma pinça para agarrar e remover órgãos internos, incluindo o SNC, intestino e traqueia. Ajuste os pinos de insetos para que o filé fique esticado, mas não esticado ao máximo.
OBSERVAÇÃO: Os músculos são ancorados à parede do corpo nos limites segmentares. Embora os músculos cubram a maior parte da parede do corpo, eles estão ausentes em uma região estreita perto da linha média dorsal.
2. Remoção muscular
- Localize a linha média dorsal da larva, onde o tecido muscular está ausente. Posicione um único pino de pinça de forma que possa ser inserido sob o tecido muscular na orientação mais plana possível.
- Começando na linha média dorsal, próximo ao limite anterior do segmento, deslize cuidadosamente a ponta da pinça entre o músculo e a epiderme, tomando cuidado para minimizar o contato entre a pinça e a epiderme.
- Puxe a pinça para cima para quebrar a fixação do músculo à parede do corpo em um ponto de ancoragem. Repita esse processo para o(s) hemissegmento(s) restante(s) de interesse.
OBSERVAÇÃO: Este protocolo otimiza a preservação da parte posterior de cada campo dendrítico do neurônio da. Para preservar a parte anterior do campo dendrítico, é melhor inserir a ponta da pinça na extremidade posterior de cada segmento.
- Reajuste os pinos dos insetos de forma que o filé larval seja esticado ao máximo em todas as direções.
- Fixe o filé enquanto ainda está preso ao prato de dissecação usando formaldeído a 4% frio e recém-preparado em PBS por 25 min.
- Enxágüe 5 vezes em PBS.
- Use uma pinça para retirar cuidadosamente o tecido muscular dos pontos de ancoragem restantes, tomando cuidado para minimizar o contato com a epiderme.
- Solte e retire o filete da cápsula de dissecação para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Execute todas as etapas subsequentes de lavagem, bloqueio e coloração por imunofluorescência, conforme descrito anteriormente em Karim e Moore, J. Vis. Exp. (2011).
