Este protocolo é um trecho de Reimels e Pfleger, Métodos para examinar a glândula linfática e hemócitos em larvas de Drosophila, J. Vis. Exp. (2016).
1. Imuno-histoquímica das glândulas linfáticas larvais
NOTA: A glândula linfática está localizada a aproximadamente um terço do comprimento da extremidade anterior de uma larva ligeiramente abaixo do cérebro no lado dorsal. (Veja a seta em Figura 1B.) A glândula linfática flanqueia o vaso dorsal e é mais facilmente dissecada presa aos ganchos da boca ou ao cérebro. Os gânglios linfáticos de terceiro ínstar do tipo selvagem são estruturas muito pequenas; Os lobos primários têm aproximadamente 100 - 200 μm de comprimento. (Consulte Figura 2A.)
- Para obter larvas aproximadamente do mesmo estágio de desenvolvimento para este ensaio, restrinja a coleta de ovos, permitindo que as fêmeas ponham ovos por um período de tempo fixo de 2 a 6 horas.
- Dissecção das glândulas linfáticas
- Para cada condição experimental, adicione 1 ml 1x PBS (Tabela 1) a um poço de uma placa de 24 poços.
- Adicione 1 gota de PBST a 0,1% (Tabela 1) a cada poço usando uma pipeta de transferência descartável.
OBSERVAÇÃO: Detergente, como o Tween 20, é adicionado para diminuir a tensão superficial, permitindo que o tecido afunde no fundo do poço.
- Coloque o prato sobre o gelo.
- Colete larvas em poços de dissecação cheios de 1x PBS.
- Coloque uma almofada de dissecação limpa em uma base de estereomicroscópio iluminada. Use uma pipeta de transferência descartável para colocar pequenas gotas de 0,01% de PBST (Tabela 1) na almofada. Transfira uma larva para uma gota de PBST para dissecação.
- Segure a larva com um par de pinças a aproximadamente um quarto do comprimento da extremidade posterior, com o lado dorsal para cima.
- Use outro par de pinças para agarrar a cutícula imediatamente anterior à pinça que está segurando a larva. Puxe suavemente a cutícula em direção à extremidade anterior até que os ganchos da boca fiquem expostos.
OBSERVAÇÃO: O objetivo é descascar a cutícula sem perturbar nenhuma estrutura interna.
- Solte a cutícula e use as duas pinças para cortar a larva em duas. Remova a extremidade posterior da gota PBST.
OBSERVAÇÃO: Se a cutícula não descascar até os ganchos da boca, corte a larva em duas e remova a extremidade posterior. Use um par de pinças para segurar a borda da cutícula e use o outro par de pinças para empurrar os ganchos da boca pela abertura. Isso irá inverter a cutícula e expor os ganchos da boca. Isso também pode ser usado como um método alternativo de dissecação.
- Use um par de pinças para fixar a cutícula (a cutícula ventral, a aba da cutícula dorsal ou ambas) para estabilidade.
- Use outro par de pinças para agarrar os ganchos da boca expostos e puxe-os com cuidado.
OBSERVAÇÃO: Isso separará a cutícula das estruturas internas. Idealmente, os discos imaginais oculares/antenais, o cérebro, a glândula anelar e a glândula linfática que flanqueiam o vaso dorsal permanecerão presos aos ganchos da boca.
- Enquanto ainda segura os ganchos bucais, remova cuidadosamente as estruturas indesejadas, como as glândulas salivares, o corpo adiposo e o intestino.
OBSERVAÇÃO: Se o cérebro se separar dos ganchos da boca, a glândula linfática ainda pode estar ligada e coletada com o cérebro. Nesse caso, segure o cordão nervoso ventral em vez dos ganchos da boca.
- Usando os ganchos bucais ou o cordão nervoso ventral como alça, transfira o complexo dissecado contendo a glândula linfática para o poço no gelo. Não exceda 30 min antes da fixação.
- Fixação e imuno-histoquímica
- Coloque a placa de 24 poços na base do estereomicroscópio.
- Use uma pipeta p200 para remover cuidadosamente o PBST do poço.
OBSERVAÇÃO: Poços vazios e vizinhos são úteis para depositar temporariamente resíduos.
- Adicione suavemente 200 μl de formaldeído a 3,7% (Tabela 1) na lateral do poço e gire a placa para garantir que os tecidos dissecados estejam completamente submersos.
- Retorne o prato ao gelo por 30 min. Se os gânglios linfáticos expressarem proteína(s) fluorescente(s), mantenha a placa coberta para evitar o fotobranqueamento.
- Use uma pipeta p200 para remover cuidadosamente o fixador.
- Lave adicionando 200 μl 1x PBS ao poço e colocando a placa em um agitador orbital por 5 min em temperatura ambiente. Use uma pipeta p200 para remover cuidadosamente o PBS.
OBSERVAÇÃO: Os gânglios linfáticos fixos podem ser deixados no gelo no PBS até que os gânglios linfáticos para todas as condições experimentais sejam dissecados e fixados.
- Repita as etapas de lavagem mais duas vezes.
- Adicione 200 μl de solução de permeabilização (Tabela 1) ao poço. Coloque a placa em um agitador orbital por 45 min em RT.
NOTA: 45 min é o "padrão ouro" para permeabilização das glândulas linfáticas, mas os autores obtiveram sucesso após apenas 20 min.
- Remova a solução com uma pipeta p200.
- Dilua o anticorpo primário com solução de anticorpos (Tabela 1) de acordo com as especificações do provedor. Adicione 300 μl de solução de anticorpo primário ao poço e certifique-se de que os tecidos dissecados estejam completamente submersos. Incubar a 4 °C durante a noite.
- Use uma pipeta p200 para remover o anticorpo primário.
- Lave adicionando 200 μl 1x PBS ao poço e colocando a placa em um agitador orbital por 10 min em temperatura ambiente. Use uma pipeta p200 para remover cuidadosamente o PBS.
- Repita as etapas de lavagem mais duas vezes.
- Dilua o anticorpo secundário com solução de anticorpos de acordo com as especificações do provedor. Adicionar 300 μl de solução de anticorpos secundários ao poço e assegurar que os tecidos dissecados estão completamente submersos. Incubar num agitador orbital durante, pelo menos, 2 horas à temperatura de saída.
- Use uma pipeta p200 para remover o anticorpo secundário e lave conforme descrito nas etapas 1.3.12 e 1.3.13. Não remova o PBS após a lavagem final.
- Montagem de glândulas linfáticas
- Limpe as lâminas de microscópio de vidro usando etanol a 70% (Tabela 1) e lenços de tecido.
- Para cada condição experimental, coloque uma gota de tampão de montagem (Tabela 1) na lâmina de vidro.
OBSERVAÇÃO: Duas condições cabem em um slide. O volume do tampão de montagem depende do número de gânglios linfáticos a serem montados. Use 2 μl para aproximadamente 18 - 20 gânglios linfáticos, 1 μl para 10 - 12 e 0,5 μl para 5 ou menos.
- Coloque a lâmina do microscópio em uma base de estereomicroscópio iluminada.
- Para até duas condições de cada vez, transfira todos os gânglios linfáticos do poço para o tampão de montagem com uma pinça, usando os ganchos da boca ou o cordão nervoso ventral como alça.
- Espace os tecidos dissecados uniformemente em uma forma circular ou retangular, espalhando o tampão de montagem no processo.
- Para cada um dos tecidos dissecados, individualmente, deslize uma pinça da pinça sob o vaso dorsal e puxe suavemente em direção à periferia do tampão de montagem.
OBSERVAÇÃO: Isso retirará a glândula linfática do resto dos tecidos dissecados e achatará a glândula linfática no vidro.
- Usando uma pinça da pinça e um movimento de serra, corte o vaso dorsal entre a glândula linfática e o cérebro.
- Mova o restante dos tecidos dissecados para o lado oposto da glândula linfática, na borda mais externa do tampão.
OBSERVAÇÃO: Os tecidos dissecados indesejados acabarão por formar um perímetro ao redor dos gânglios linfáticos e servirão como suporte sobre o qual a lamínula repousará.
- Repita até que todos os gânglios linfáticos estejam separados dos tecidos dissecados, reservando um dos tecidos dissecados indesejados para colocar no centro.
- Pegue uma lamínula entre dois dedos. Verifique se a lamínula está livre de poeira e impressões digitais. Se necessário, use um lenço de papel e etanol 70% para limpar a lamínula.
- Certificando-se de que a borda da lamínula esteja paralela à borda da corrediça de vidro, abaixe cuidadosamente a lamínula sobre o buffer de montagem.
OBSERVAÇÃO: As lâminas de microscópio podem ser armazenadas a 4 °C antes da aquisição de imagens. O tempo máximo de armazenamento depende da estabilidade dos anticorpos utilizados. As placas de 24 poços podem ser enxaguadas e reutilizadas.
2. Exames por imagem
- Imagem de hemócitos fixos e gânglios linfáticos montados em um microscópio confocal ou de fluorescência padrão apropriado com ampliação de 20X ou superior, de acordo com o manual de operação do fabricante. Imagem de larvas inteiras em um estereomicroscópio padrão com ampliação de 2X de acordo com o manual de operação do fabricante.
- Siga as instruções do provedor de software para deconvolução, se desejar.
