Este protocolo é um trecho de Kelly et al., Dissecção e coloração imunofluorescente de neurônios do corpo do cogumelo e fotorreceptores em cérebros adultos de Drosophila melanogaster, J. Vis. Exp. (2017).
1. Preparação da Estação de Dissecção
- Posicione o estereomicroscópio e a fonte de luz com goosenecks de fibra óptica conectados em uma bancada grande. Para promover movimentos constantes das mãos e reduzir o "tremor" das mãos durante a dissecação, é essencial que haja espaço adequado para apoio de mãos e braços ao redor do microscópio. Certifique-se de que haja aproximadamente 8 a 10 polegadas de cada lado do microscópio e 4 a 6 polegadas entre a base do microscópio e a borda da bancada.
- Encha 2 ou 3 poços de um prato de vidro de 9 ou 3 poços com 1,0 mL de tampão PTN (tampão fosfato de sódio 0,1 M pH 7,2, surfactante não iônico a 0,1%, consulte a Tabela de Materiais para componentes completos do tampão) e coloque ao lado da estação de dissecação no gelo. Os cérebros recém-dissecados serão transferidos para esta placa e armazenados até a etapa de fixação.
OBSERVAÇÃO: Se for necessária uma imagem ao vivo, o tampão de dissecção deve ser 1x tampão com fosfato salino (PBS) ou tampão HL3. Se a localização de proteínas intracelulares for necessária, o PBS também pode ser usado como um tampão alternativo para dissecção e fixação. Após a fixação, a permeabilização das membranas celulares deve ser realizada usando lavagens PTN contendo 0,1% ou 0,3% de detergente não iônico.
- Se o PBS for usado para dissecções e fixação, as pontas da pipeta devem ser enxaguadas pelo menos uma vez com um tampão contendo detergente (como PTN) para evitar que os cérebros grudem nas pontas da pipeta de plástico durante a transferência para tubos de microcentrífuga.
- Utilizando uma placa de Petri de vidro ou plástico vazia de 35 mm, construir uma placa de dissecação contendo um elastómero de silicone. Resumidamente, misture os componentes do elastômero de acordo com as instruções do fabricante, despeje em pratos de 35 mm e deixe polimerizar durante a noite em uma superfície plana. Placas de dissecação contendo elastômero devem ser usadas para proteger as pontas finas das pinças de dissecação, que podem ser facilmente danificadas se o contato for feito entre a pinça e uma superfície mais dura, como uma placa de vidro. Também compramos regularmente pratos revestidos de silicone disponíveis comercialmente em varejistas on-line. Para aumentar o contraste durante as dissecações, placas de dissecação de elastômero de silicone contendo carvão inativado (e, portanto, de cor preta) são particularmente úteis.
2. Procedimento de Dissecção do Cérebro em Adultos
- Anestesiar D. melanogaster adulto de 3 a 5 dias com CO2 ou usando gelo. Se estiver usando gelo, coloque o frasco contendo moscas de cabeça para baixo (extremidade do plugue para baixo) em um balde de gelo por ~ 5 min. Colocar o frasco para injetáveis no gelo de cabeça para baixo evita que as moscas se alojem nos alimentos. Depois que as moscas forem anestesiadas, coloque-as em uma almofada de metal fria ou placa de Petri no gelo ou em uma almofada de mosca emissora de CO2. Se dissecar cérebros para analisar a neurodegeneração, moscas mais velhas também podem ser usadas.
- Coloque uma pequena quantidade (150 - 200 μL) de PTN no centro da placa de dissecação usando uma pipeta de transferência ou uma pipeta p200 para criar uma "bolha" de PTN. Coloque a placa de dissecação sob o estereomicroscópio e ajuste a iluminação e o foco de modo que a bolha de PTN preencha o campo de visão e seja uniformemente iluminada.
- Manipule as moscas para que fiquem "de barriga para cima" (ou seja, com o lado ventral para cima) enquanto estiverem deitadas sobre a almofada de metal ou CO2.
- Usando um par de pinças #5, segure o abdômen de uma mosca a ser dissecada e, segurando a mosca, mergulhe-a completamente no PTN na placa de dissecação.
OBSERVAÇÃO: Para o restante do protocolo, todas as etapas devem ser executadas enquanto a cabeça está submersa em PTN.
- Usando um segundo par de pinças # 5, segure a base da tromba da mosca e separe os dois pares de pinças para separar a cabeça da mosca do corpo. Descarte o abdômen e o tórax. Durante esta etapa, é fundamental que a cabeça não seja liberada e possa flutuar na superfície do PTN. Uma vez que a cabeça está flutuando, pode ser muito difícil agarrá-la novamente sem esmagar o cérebro.
OBSERVAÇÃO: Usando este método, as conexões entre o cérebro e o cordão nervoso ventral são cortadas. Se forem necessárias conexões intactas entre essas regiões do SNC, um protocolo de dissecção alternativo deve ser seguido. Se a tromba se desprender da cabeça da mosca antes que a cabeça seja removida, haverá um orifício onde estava a tromba. Nesse caso, segure a cabeça da mosca na borda do orifício perto de um olho. Em seguida, remova a cabeça usando uma quantidade moderada de força enquanto separa os dois pares de pinças um do outro. Ocasionalmente, quando a cabeça é removida do corpo, o intestino e/ou o cordão nervoso ventral permanecem presos à cabeça e devem ser removidos antes de continuar a dissecção.
- Enquanto um par de pinças agarra a tromba, o segundo par deve agarrar a borda medial do olho direito da mosca. Lentamente, afaste as pinças uma da outra. Esta etapa deve ser executada com uma pequena quantidade de força lateral constante. À medida que as pinças se afastam lentamente uma da outra, a tromba deve se afastar da cabeça e criar um orifício central na cutícula da cabeça. Descarte a tromba com o primeiro par de pinças sem soltar a porção medial do olho direito do segundo par.
OBSERVAÇÃO: O cérebro adulto de D. melanogaster está na região caudal (ou seja, posterior / traseira) da cabeça da mosca. Assim, deve-se evitar agarrar essa região da cabeça. Idealmente, apenas a porção rostral (ou seja, frontal) da cabeça perto da retina medial deve ser agarrada diretamente pela pinça. O cérebro e a traqueia associada agora devem ser visíveis através do orifício central da cutícula. Neste momento, quaisquer fios fibrosos brancos da traqueia que se projetam do orifício podem ser removidos e descartados.
- Com o segundo par de pinças, segure a borda medial da retina esquerda (na borda do orifício central na cutícula da cabeça). Para remover as retinas e a cutícula associada, puxe lentamente as pinças uma para longe uma da outra em um ângulo de 180°. À medida que a retina se dissocia do lobo óptico subjacente, você deve sentir uma ligeira diminuição na tensão. Proceda lentamente para evitar o rompimento do lobo óptico.
OBSERVAÇÃO: Separar a pinça muito rapidamente durante esta etapa pode resultar na ruptura do lobo óptico ou na ruptura das estruturas do corpo do cogumelo. Ocasionalmente, a cutícula será removida, mas pedaços da retina permanecerão presos ao lobo óptico. Se a imagem dos corpos dos cogumelos, não é completamente necessário remover toda a retina. No entanto, a análise de outras regiões cerebrais (como a inervação dos neurônios da retina dos lobos ópticos do cérebro) pode exigir que a retina seja completamente removida, conforme descrito por.
OBSERVAÇÃO: Como a retina é lentamente separada do lobo óptico subjacente do cérebro, o lobo óptico deve ser observável como uma estrutura branca opaca coberta por uma traqueia branca e fibrosa. Uma vez que uma retina tenha sido removida, ela pode ser descartada. Ao analisar o pathfinding dos neurônios da retina, deve-se tomar cuidado especial durante esta etapa para evitar danos ao lobo óptico. Um protocolo adicional focado na dissecção e imagem ao vivo dos neurônios fotorreceptores também está disponível.
- Agora, remova cuidadosamente o máximo possível da traqueia visível. A traqueia já pode conter ou mais tarde se encher de ar, fazendo com que os cérebros flutuem e, potencialmente, sejam perdidos durante as etapas posteriores de imunocoloração. Para remover a traqueia, retire-a do cérebro usando um par de pinças # 5 muito afiadas.
- Remova a retina restante e a cutícula circundante usando os dois pares de pinças para agarrar a região medial da retina da mosca esquerda. Rasgue cuidadosamente a retina ao meio para remover pedaços da retina e da cutícula. Em alguns casos, remover a cutícula restante sem esmagar o cérebro é especialmente desafiador. Nesses casos, descobrimos que os fios restantes do cordão nervoso ventral podem ser agarrados por um par de pinças, enquanto o outro par de pinças é usado para remover cuidadosamente o resto da cutícula.
- Usando uma pipeta p200, mova os cérebros dissecados para um poço do prato de 9 ou 3 poços contendo PTN. Cérebros do mesmo genótipo devem ser agrupados no mesmo poço e mantidos no gelo. O tecido cerebral deve ser fixado dentro de uma hora após a dissecção. Os cérebros podem ser fixados em pequenos lotes e agrupados se for necessário um número maior de cérebros. Na maioria das circunstâncias, um pesquisador experiente geralmente pode dissecar um cérebro e transferi-lo para o prato de coleta de vidro em aproximadamente 3 a 5 minutos.
