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Este protocolo é um trecho de Koyle et al., Criando a mosca-da-fruta Drosophila melanogaster sob condições axênicas e gnotobióticas, J. Vis. Exp.(2016).
1. Prepare gaiolas de postura de ovos
- Faça pratos de ágar suco de uva colocando no micro-ondas 100 ml de água, 10 g de levedura de cerveja, 10 g de glicose e 1 g de ágar. Deixe ferver 3 vezes na etapa 1.1 e adicione 10 g de concentrado de suco de uva congelado para aumentar a visibilidade dos ovos na placa de ágar.
- Quando o ágar-ágar tiver arrefecido a 55 °C, deitar 20 ml em placas de Petri de 100 mm e deixar solidificar.
- Cubra a superfície das placas de ágar com uma pasta de fermento, misturando 1 g de fermento de cerveja com 15 g de água. Despeje a pasta de fermento na placa de ágar, certificando-se de que a superfície esteja coberta, depois despeje o excesso, deixando um resíduo fino de fermento para trás. Se várias placas forem usadas, a pasta pode ser derramada sequencialmente em várias placas.
- Transfira as placas de ágar para o fundo de uma gaiola.
OBSERVAÇÃO: Um recipiente de delicatessen de 32 onças é um bom substituto para gaiolas de acrílico.
- Faça tampas para recipientes de delicatessen de 32 onças cortando um orifício na parte superior e colando uma malha respirável sobre o orifício com cola não tóxica. Se a cola for solúvel em água, evite a exposição à água na tampa.
- Transfira 200-300 moscas para o recipiente e cubra com a tampa. Cubra o orifício protegido pela malha com uma tampa de placa de Petri vazia para evitar a evaporação da superfície do ágar e adicione um lenço de papel úmido dentro da tampa, se desejar. Incubar moscas a 25 °C durante a noite por 16-20 horas.
2. Colete ovos
- Prepare uma peneira para a coleta de ovos colocando uma malha de náilon em uma bucha de plástico.
- Para recuperar o prato com ovos, remova as moscas da gaiola transferindo-as para um recipiente vazio. Se as mesmas moscas forem usadas no dia seguinte, transfira imediatamente para uma nova gaiola contendo um prato de ágar suco de uva recém-fermentado. As moscas podem ser usadas por 3-5 dias sequenciais
- Remova as moscas mortas do ágar com um pincel limpo, tomando cuidado para não quebrar o ágar.
- Colete os ovos enxaguando a placa de ágar com água destilada, escovando suavemente os ovos da superfície do ágar e despejando a pasta sobre a malha. Repita 3-4 vezes até que todos ou a maioria dos ovos tenham sido removidos da placa de ágar.
3. Ovos descorionados e transferência para dieta estéril
- Prepare o gabinete de biossegurança pulverizando o interior (incluindo as laterais) com etanol 70%. Limpe o fundo com um lenço de papel e esterilize o capuz com luz ultravioleta por ~ 15 min. Esterilize todos os suprimentos não biológicos (copos de amostra, pincel, pinça, recipiente de lixo, 400 ml de água esterilizada e 100 ml de hipoclorito de sódio a 0,6%) pulverizando com etanol e colocando imediatamente no gabinete de biossegurança. Esterilize com luz UV por 15 min.
- Comece a primeira das 2 lavagens com hipoclorito de sódio colocando a bucha com os ovos em um copo de amostra de 120 ml ou outro recipiente estéril. Despeje lentamente ~ 90 ml de solução de hipoclorito de sódio a 0.6% na bucha até um pouco abaixo da borda.
- Enxágue os ovos por 2,5 min. Ressuspenda periodicamente os ovos usando uma pinça para mover a bucha para cima e para baixo na solução de hipoclorito.
- Transfira a bucha diretamente para um segundo copo de amostra, pré-preenchido com 90 ml de alvejante, dentro do gabinete de biossegurança.
- Repita a etapa 3.3 dentro do gabinete de biossegurança. No final do segundo tratamento com alvejante, os ovos devem começar a aderir às laterais da bucha.
- Execute as etapas 3.7-3.8 no gabinete de biossegurança.
- Descarte o alvejante e lave a bucha com água estéril 3 vezes. Ressuspenda os ovos várias vezes durante cada lavagem, movendo a bucha com uma pinça. No final da terceira lavagem, a maioria dos ovos deve ser presa na lateral da bucha.
- Usando um pincel esterilizado em etanol, transfira os ovos da lateral da bucha para a dieta estéril. Transfira os ovos individualmente ou em pequenos lotes. Apontar para 30-50 ovos por frasco. Deixe as tampas soltas para permitir que o oxigênio entre no tubo.