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Este protocolo é um trecho de Guan et al., Visualize Drosophila Leg Motor Neuron Axons Through the Adult Cuticle, J. Vis. Exp.(2018).
1. Dissecção e fixação da perna
- Pegue uma placa de vidro de vários poços e encha o número apropriado de poços com etanol a 70%. Adicione 15-20 moscas anestesiadas com CO2 (de ambos os sexos e de qualquer idade) a cada poço e, usando uma escova, passe suavemente as moscas na solução de etanol até que as moscas estejam totalmente submersas.
OBSERVAÇÃO: Esta etapa é para remover a hidrofobicidade da cutícula. Não lave por mais de 1 min, pois isso aumenta a autofluorescência da cutícula.
- Enxágue as moscas 3 vezes com solução de detergente surfactante não iônico a 0,3% em 1x solução salina tamponada com fosfato (PBS). Mantenha as moscas nesta solução por pelo menos 10 min.
OBSERVAÇÃO: As pernas ficam melhor fixadas ao incluir detergente, o que provavelmente aumentará a penetração do fixador dentro da perna.
- Coloque uma placa de vários poços no gelo junto com um tubo de paraformaldeído (PFA) a 4%.
OBSERVAÇÃO: A preparação de PFA fresco a 4% a partir de uma solução estoque livre de etanol a 16% de PFA é crítica.
- Use uma pinça para remover a cabeça e o abdômen das moscas sem danificar o segmento torácico ou as pernas.
OBSERVAÇÃO: A remoção do abdômen torna mais fácil segurar a mosca e dissecar as pernas.
- Disseque as pernas do segmento torácico com uma pinça e coloque as pernas nos poços contendo 4% de PFA. Para isso, empurre suavemente, mas com firmeza, a junção coxa-tórax usando a ponta de uma pinça fina até que a perna se desprenda.
- Fixe as pernas em PFA a 4% durante a noite a 4 °C (aproximadamente 20 h no total).
- Lave as pernas com solução de detergente surfactante não iônico a 0,3% em 1x PBS, 5x por 20 min cada.
- Substitua o tampão de lavagem por meio de montagem. Mantenha a perna no meio de montagem por pelo menos um dia antes da montagem para permitir sua penetração completa na perna.
OBSERVAÇÃO: Se o meio de montagem for altamente viscoso, dilua o meio de montagem para 80% com 1x PBS, pois a mudança repentina na viscosidade pode causar o colapso da cutícula e danificar a estrutura geral da perna. Dependendo do driver Gal4, as moscas podem ser preservadas por 1 a 3 semanas a 4 °C no meio de montagem até a montagem.
2. Montagem da perna
- Coloque aproximadamente 20 μL de glicerol a 70% no lado esquerdo de uma lâmina de microscópio e cubra com uma lamínula quadrada de 22 x 22 mm2 (Figura 1A,B). Pipetar cerca de 10 μl de meio de montagem ao longo de uma linha paralela e a uma pequena distância da borda direita desta lamínula. Adicione mais 30 μL de meio de montagem mais adiante no lado direito da lâmina (Figura 1C).
OBSERVAÇÃO: Ao aplicar uma lamínula sobre as pernas (veja abaixo), o meio de montagem se espalhará suavemente sob a lamínula e ao redor das pernas sem deslocá-las.
- Usando uma pinça fina, levante a perna da solução e coloque-a suavemente no meio de montagem próximo à lamínula esquerda. Faça o mesmo para cada perna e alinhe-as de cima para baixo (Figura 1D).
- Levante e transfira as pernas em uma gota de meio presa entre as duas pontas da pinça. Oriente as pernas de duas maneiras: lado externo para cima ou para baixo.
- Uma vez que todas as pernas (até 6–8 pernas podem ser montadas) estejam devidamente alinhadas, coloque uma segunda lamínula sobre as pernas de modo que esta lamínula fique ligeiramente apoiada na lamínula colocada anteriormente Figura 1E para permitir espaço entre a lamínula e o tecido e para evitar que as pernas sejam danificadas (Figura 1G).
OBSERVAÇÃO: Como alternativa, use poços adesivos ou cera ortodôntica para criar espaço entre a lamínula e a lâmina.
- Use um esmalte para fixar a posição das lamínulas em cada canto (Figura 1F).
OBSERVAÇÃO: O tecido agora está pronto para ser visualizado.
