Preparação de oócitos fixos de Drosophila para imunocoloração: um método de alto rendimento para fixar e remover a membrana externa

Resumo

Fonte: Radford, S. J., McKim, K. S. Técnicas para Imagem Prometáfase e Metáfase da Meiose I em Oócitos Fixos de Drosophila. J. Vis. Exp. (2016).

A imunocoloração de oócitos em estágio avançado de Drosophila pode ser desafiadora devido às membranas circundantes dos oócitos. Este vídeo descreve um método de alto rendimento para obtenção de oócitos, sua fixação e remoção de membranas para imunocoloração. O protocolo apresentado demonstra essas técnicas com oócitos em estágio avançado usados para visualizar diferentes estágios da meiose.

Protocolo

Este protocolo foi extraído de Radford e McKim, Técnicas para imagem de prometáfase e metáfase da meiose I em oócitos fixos de Drosophila, J. Vis. Exp. (2016).

NOTA: Os procedimentos são realizados à temperatura ambiente, salvo indicação em contrário. As incubadoras com temperatura controlada são usadas para manter as temperaturas para criação de moscas e cruzamentos, salvo indicação em contrário.

1. Preparativos

1. Prepare moscas.
   1. Coleções de oócitos enriquecidas com prometáfase.
      1. Moscas adultas claras de animais saudáveis, jovens ....

Resultados

medicamento	solvente	Concentração de estoque	Concentração final	Tempo de tratamento	efeito
colquicina	etanol	125 mM	150 μM	10 min ou 30 min	desestabilizar não cinetocoro (10 min) .......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
16% de formaldeído	Ted Pella, Inc.	18505	PERIGOSO; uma vez aberto, descarte após um mês
Copos de 250 ml	vário
Tubos de 5 ml	vário
fermento seco ativo	vário		Misture com água para fazer uma pasta com a consistência de manteiga de amendoim
Binucleína 2	sigma	B1186	perigoso
liquidificador	vário
albumina de soro bovino	sigma	Rolamento A4161
cloreto de cálcio	vário
colquicina	sigma	C-9754	perigoso
lamínulas	VWR	Rolamento 48366-227	Nº 1 1/2
Dmso	vário
EGTA	vário
etanol	vário
fórceps	Ted Pella, Inc.	Rolamento 5622	Pinças Dumont de alta precisão grau estilo 5
corrediças de vidro	VWR	Nº 48312-003
glicose	vário
HEPES	VWR	EM-5330	Disponível em vários vendedores
cloreto de magnésio	vário
malha grande (~1.500 μm)	VWR	AA43657-NK	variedade de formatos e outros fornecedores, malha 12 ou 14
malha pequena (~300 μm)	Laboratórios de espectro	146 424	variedade de formatos, por exemplo, 146 422 ou 146 486
nutador	vário
Pipetas Pasteur	vário
acetato de potássio	vário
Ácido cacodílico	sigma	C0125	PERIGOSO; alternativamente, o cacodilato de sódio pode ser substituído
hidróxido de potássio	vário
acetato de sódio	vário
hidróxido de sódio	vário
sacarose	vário
taxol (paclitaxel)	sigma	T1912	perigoso
Tritão X-100	pescador	PI-28314
Pré-adolescente 20	pescador	PI-28320
vórtice	vário