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Este protocolo foi extraído de Radford e McKim, Técnicas para imagem de prometáfase e metáfase da meiose I em oócitos fixos de Drosophila, J. Vis. Exp. (2016).
NOTA: Os procedimentos são realizados à temperatura ambiente, salvo indicação em contrário. As incubadoras com temperatura controlada são usadas para manter as temperaturas para criação de moscas e cruzamentos, salvo indicação em contrário.
1. Preparativos
- Prepare moscas.
- Coleções de oócitos enriquecidas com prometáfase.
- Moscas adultas claras de animais saudáveis, jovens ou culturas cruzadas. Garrafas de envelhecimento por dois dias a 25 °C.
OBSERVAÇÃO: Geralmente, duas garrafas saudáveis serão suficientes, embora mais possam ser necessárias para algumas culturas cruzadas.
- Após dois dias, colete ~ 100 a 300 fêmeas (que têm de 0 a 2 dias de idade neste momento) das garrafas. As fêmeas não precisam ser virgens. Adicione um pouco de pasta de fermento na lateral de um frasco e coloque 30 fêmeas e 10 a 15 machos cada nos frascos de fermento. Frascos para injetáveis de envelhecimento durante dois dias a 25 °C.
- Coleções de oócitos enriquecidas com metáfase.
- Colete ~ 100 a 300 fêmeas de culturas cruzadas ou cruzadas. Adicione um pouco de pasta de fermento na lateral de um frasco e coloque 30 fêmeas cada (sem adição de machos) nos frascos de fermento. Frascos para injetáveis de envelhecimento durante três a cinco dias a 25 °C.
- Preparar Soluções.
OBSERVAÇÃO: As soluções podem ser armazenadas indefinidamente à temperatura ambiente, salvo indicação em contrário.
- Prepare o tampão de Robb modificado (5x): 500 mM HEPES, 500 mM de sacarose, 275 mM de acetato de sódio, 200 mM de acetato de potássio, 50 mM de glicose, 6 mM de cloreto de magnésio e 5 mM de cloreto de cálcio. Use hidróxido de sódio 10 N 11:8: hidróxido de potássio para trazer o pH para 7,4. Esterilizar por filtração; Não autoclave. Armazene a -20 ° C. Descongele conforme necessário para preparar ~ 200 ml de 1x Robb's por preparação de oócito.
- Soluções de fixação.
- Opção # 1: Prepare a fixação de formaldeído / heptano. Prepare o tampão de fixação: 1x solução salina tamponada com fosfato (PBS) mais 150 mM de sacarose. Para usar, faça fresco com 687,5 μl de tampão de fixação e 312,5 μl de formaldeído a 16% por preparação de oócito.
cuidado: Use luvas ao usar soluções de formaldeído em uma capela de exaustão. Descarte os resíduos de acordo com as diretrizes institucionais.
- Opção # 2: Prepare a fixação de formaldeído / cacodilato. Prepare o Fix Mix: 250 mM de sacarose, 100 mM de acetato de potássio (pH 7,5), 25 mM de acetato de sódio (pH 7,0) e 25 mM de EGTA (pH 8,0). Para usar, faça fresco com 400 μl de Fix Mix, 100 μl de cacodilato de potássio (1 M, pH 7,2) e 500 μl de formaldeído a 16% por preparação de oócito.
cuidado: O cacodilato de potássio contém arsênico.
- Prepare PBS/Triton X-100: 1x PBS mais 1% ou 0,05% Triton X-100. Conservar a 4 °C.
- Prepare PBS-Tween 20-Albumina de soro bovino (BSA) (PTB): 1x PBS, 0,5% BSA (p / v) e 0,1% Tween-20. Pode ser conservado a 4 °C durante uma semana.
2. Coleta de oócitos de Drosophila em estágio avançado
- Como os oócitos de Drosophila com membranas intactas aderem ao plástico e ao vidro, pré-revestir o interior de um tubo de 5 ml e uma pipeta de Pasteur por preparação de oócito com PTB.
- Anestesie todas as ~ 100 a 300 moscas fermentadas com dióxido de carbono e adicione a um liquidificador contendo ~ 100 ml 1x Robb's Buffer. Pulsar três vezes (~1 seg cada). Mantenha os oócitos no Robb's por <20 min para evitar a ativação.
OBSERVAÇÃO: Alternativamente, os oócitos podem ser dissecados manualmente das fêmeas. A vantagem desse método é que ele requer menos fêmeas. No entanto, deve-se tomar cuidado para limitar a exposição ao dióxido de carbono a apenas alguns minutos para evitar artefatos associados à hipóxia.
- Filtrar através de malha grande (~1.500 μm) para um copo de 250 ml para remover partes grandes do corpo. Se muitos abdômens intactos permanecerem na malha, triture novamente o material usando o Robb's Buffer adicional e filtre novamente. Deixe repousar ~ 2 min e, em seguida, aspire a camada superior, removendo o máximo possível das partes grandes do corpo.
- Filtrar através de uma pequena malha (~300 μm) para um copo de 250 ml. Enxágue os oócitos restantes do primeiro copo usando Robb's adicional e pipeta Pasteur revestida. Deixe repousar ~3 min; os oócitos se acomodarão. Aspire tudo, exceto ~ 10 ml.
- Despeje o máximo de 10 ml que couber no tubo revestido de 5 ml. Deixe repousar, remova o líquido e repita com o restante. Enxágue os oócitos restantes do béquer usando Robb's adicional e pipeta Pasteur revestida. Deixe repousar em tubo de 5 ml por ~ 3-5 min.
3. Tratamentos medicamentosos (opcional)
- Cubra um segundo tubo de 5 ml com PTB para cada preparação de oócito. Adicione solvente apropriado (controle) ou medicamento a 1 ml de Robb's cada para cada preparação de oócito (Tabela 1).
- Divida os oócitos em um segundo tubo revestido de 5 ml. Deixe repousar, remova o líquido e adicione 1 ml de solvente Robb's plus em um tubo e 1 ml de Robb's plus drug no segundo tubo. Nutato por tempo adequado para tratamento medicamentoso (Tabela 1). Deixe resolver.
4. Fixação
- Aspire todo o líquido e adicione imediatamente 1 ml de Fix.
- Opção #1: Fixação de formaldeído/heptano (tampão de fixação mais 5% de formaldeído).
- Fixe por 2,5 min em um nutator. Adicione 1 ml de heptano e vórtice 1 min. Deixe repousar ~1 min.
- Remova todo o líquido e adicione 1 ml 1x PBS. Vórtice 30 seg. Deixe repousar ~1 min.
- Remova todo o líquido e, em seguida, encha o tubo com 1x PBS.
OBSERVAÇÃO: Os oócitos podem ser usados imediatamente ou mantidos no nutador por várias horas em temperatura ambiente.
- Opção #2: Fixação de formaldeído/cacodilato (Fix Mix mais 8% de formaldeído e 100 mM de cacodilato).
- Fixe por 6 min em um nutator. Deixe repousar 2 min. Remova o líquido e encha o tubo com 1x PBS.
OBSERVAÇÃO: Os oócitos podem ser usados imediatamente ou mantidos no nutador por várias horas em temperatura ambiente.
5. Removendo Membranas ("Rolamento")
- Usando pipeta Pasteur revestida, adicione ~ 500 a 1.000 oócitos à parte fosca (jateada) de uma lâmina de vidro. Remova todas as partes do corpo e materiais estranhos usando uma pinça. Não deixe os oócitos secarem; adicione 1x PBS conforme necessário.
- Coloque uma lamínula em cima dos oócitos e "role" suavemente os oócitos até que todas as membranas sejam removidas (arrastar a borda da lamínula pelos oócitos funciona melhor). Verifique periodicamente o progresso ao microscópio, adicionando mais 1x PBS conforme necessário. Tome cuidado, pois muita pressão destruirá os oócitos.