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$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Este protocolo é um trecho de Perkins e Bickel, Usando hibridização in situ fluorescente (FISH) para monitorar o estado da coesão do braço em oócitos de Drosophila prometáfase e metáfase I, J. Vis. Exp. (2017).
1. Remoção de córions e membranas vitelinas
NOTA: Consulte Figura 1 para obter as ferramentas necessárias.
- Separe os oócitos em estágio avançado
- Adicione 1 mL de PBSBTx a um prato de dissecação raso. Use um P200 com uma ponta revestida com BSA para transferir ovários fixos (em ~ 150 μL) para o prato raso. Pipetar os ovários para cima e para baixo com a ponta da pipeta revestida com BSA para desalojar os oócitos maduros dos oócitos menos maduros.
- Quando os oócitos em estágio avançado estiverem suficientemente separados, transfira todo o tecido para um tubo de microcentrífuga de 500 μL. Remova o excesso de líquido com uma pipeta Pasteur puxada, deixando cerca de 150 - 200 μL no tubo. Repita a seção 1.1 para os genótipos restantes.
- Prepare-se para rolar
- Umedeça previamente um prato de poço fundo com 200 μL de PBSBTx. Cubra e reserve. Obtenha 3 lâminas de vidro fosco e coloque a lâmina #3 de lado. Esfregue suavemente as regiões de vidro fosco das lâminas # 1 e # 2 juntas. Enxágue-os em água deionizada para remover quaisquer cacos de vidro e seque com um lenço descartável.
- Cubra as regiões foscas das lâminas # 1 e # 2 com PBSBTx adicionando 50 μL de PBSBTx a uma lâmina e esfregando essa região com a outra lâmina. Remova o líquido com um lenço descartável.
- Coloque as lâminas sob um microscópio de dissecação na configuração mostrada em Figura 2A. Mantenha as regiões foscas das lâminas #1 e #2 em contato, com a lâmina #3 apoiando a lâmina #2.
- Enrole os ovócitos; certifique-se de que a direção do rolamento seja sempre em linha reta e nunca em movimento circular.
- Umedeça previamente a ponta de uma pipeta P200 em PBSBTx e disperse os oócitos no tubo de microcentrífuga pipetando para cima e para baixo. Transfira 50 μL de líquido contendo oócitos para o centro da parte de vidro fosco da lâmina #1. Levante o slide # 2 para fazer isso.
- Abaixe lentamente o slide #2 até que a tensão superficial do líquido crie uma vedação entre as duas regiões de vidro fosco. Deve haver líquido suficiente para cobrir a área fosca, mas nenhum deve vazar. Se o líquido estiver transbordando, use uma pipeta Pasteur puxada para remover o excesso de líquido.
- Segure o slide inferior (#1) no lugar com uma mão e use a outra mão para mover o slide superior (#2) para frente e para trás na direção horizontal, mantendo o slide #2 nivelado e apoiado no slide #3. Realizar sob microscópio para facilitar a visualização dos movimentos e progresso dos oócitos.
OBSERVAÇÃO: Esse movimento vai gerar atrito e fazer com que os oócitos "rolem" e percam seus córions. Deve-se usar pressão mínima e movimentos curtos e rápidos.
- Após alguns movimentos na direção horizontal, altere ligeiramente o ângulo de movimento (Figura 2B). Em incrementos múltiplos, aumente gradualmente este ângulo para 90° até que o movimento da corrediça superior seja perpendicular à direção inicial (Figura 2B). Observe que os córions vazios serão visíveis no líquido e os oócitos sem córions parecerão mais longos e mais finos.
- Repita as etapas 1.3.3 - 1.3.4 cerca de 7 a 10 vezes até que a solução fique ligeiramente turva. Pare de rolar quando a maioria dos oócitos (75 - 85%) parecer ter perdido suas membranas vitelinas.
OBSERVAÇÃO: Uma extremidade pontiaguda distinta é frequentemente visível em oócitos sem membranas vitelinas. As membranas vitelinas são mais difíceis de remover do que os córions. Uma leve pressão pode ser aplicada à corrediça superior (slide # 2) durante o rolamento para obter a remoção das membranas vitelinas. Tentar remover as membranas vitelinas de todos os oócitos geralmente resulta na destruição de outros oócitos.
- Levante suavemente a lâmina superior (#2), arrastando um de seus cantos para o centro da região fosca da lâmina inferior (#1) para que os oócitos enrolados se acumulem no centro da região fosca. Lave os oócitos de ambas as lâminas com PBSBTx no prato de poço fundo contendo PBSBTx.
- Limpe as lâminas #1 e #2 com água ultrapura, seque com um lenço descartável e reinicie. Repita as etapas 1.3.1 - 1.3.6 até que todos os oócitos do mesmo genótipo tenham sido enrolados. Isso geralmente requer 3 a 4 rodadas de laminação por genótipo.
- Remova os detritos após a laminação
- Adicione 1 mL de PBSBTx a um tubo cônico de 15 mL. Agite o líquido para revestir as laterais do tubo.
- Usando uma ponta de pipeta P1000 revestida com PBSBTx, transfira os oócitos enrolados do prato de poço fundo para o tubo cônico contendo 1 mL de PBSBTx. Adicione mais 2 mL de PBSBTx ao tubo cônico que contém os oócitos.
- Deixe os oócitos começarem a assentar no fundo, em seguida, remova os 2 mL superiores da solução contendo detritos (córions, vitelinas, etc.) com um P1000 e descarte. Se necessário, segure o tubo cônico contra um fundo escuro para ver os oócitos opacos enquanto eles afundam.
- Adicione mais 2 mL de PBSBTx aos oócitos e repita a etapa 1.4.3. Repetir o ponto 1.4.3. para um total de 3 rodadas de remoção de detritos.
- Usando uma ponta de pipeta P1000 revestida com PBSBTx, transfira os oócitos de volta para o tubo de microfífugo original de 500 μL. 20 - 25 fêmeas devem produzir aproximadamente 50 μL de oócitos maduros enrolados.
- Repita a seção 4 para os genótipos restantes usando lâminas frescas congeladas, um prato de poço fundo limpo e um novo tubo cônico para cada genótipo.
- Se o armazenamento for necessário, transfira os oócitos para 1x PBS com 0,1% de TritionX-100 e armazene durante a noite a 4 °C. O armazenamento a longo prazo não é recomendado porque a reticulação do formaldeído pode ser revertida por detergentes não iônicos.
