Ruptura da cutícula: um método para coletar hemolinfa de larvas de Drosophila

Resumo

Fonte: Reimels, T. A. e Pfleger, C. M. Métodos para examinar a glândula linfática e hemócitos em larvas de Drosophila. J. Vis. Exp. (2016).

A hemolinfa da Drosophila serve como sangue e fluido intersticial, circulando por todo o corpo durante os estágios larva e adulto. Este vídeo descreve um protocolo de coleta de hemolinfa larval para quantificar as células circulantes.

Protocolo

Este protocolo é um trecho de Reimels e Pfleger, Métodos para examinar a glândula linfática e hemócitos em larvas de Drosophila, J. Vis. Exp.(2016).

1. Concentração de hemócitos circulantes

1. Para obter larvas aproximadamente do mesmo estágio de desenvolvimento para este ensaio, restrinja a coleta de ovos, permitindo que as fêmeas ponham ovos por um período de tempo fixo de 2 a 6 horas.
2. Colete as larvas em poços de dissecação cheios de solução salina tamponada com fosfato 1x (PBS).
3. Para cada larva, coloque 10 μl 1x PBS em um tubo de microcentrífuga no gelo e 10 μl 1x PBS em uma almofada de dissecação limpa. Coloque a almofada de dissecação em uma base de estereomicroscópio iluminada.
4. Seque uma larva individual colocando-a em um lenço de papel antes de transferi-la para uma gota de PBS na almofada de dissecação.
5. Usando uma pinça, rasgue suavemente e inverta cuidadosamente a cutícula para liberar a hemolinfa.
   OBSERVAÇÃO: Tome cuidado para não raspar ou espetar a cutícula, pois isso pode liberar hemócitos sésseis.
6. Usando uma pipeta, colete a hemolinfa da almofada de dissecação. Evite coletar detritos larvais, como o corpo gordo.
7. Adicione a hemolinfa a um tubo de microcentrífuga e misture pipetando para cima e para baixo.
   OBSERVAÇÃO: Várias amostras podem ser coletadas de uma só vez e mantidas no gelo por até uma hora.
8. Opcional: Misture o azul de tripano com a amostra de hemolinfa em partes iguais para tingir e excluir as células mortas. Conte as células dentro de 3 minutos após a adição de azul de tripano porque é tóxico para as células.
9. Misture a amostra pipetando para cima e para baixo antes de carregar 10 μl em uma câmara de hemocitômetro.
10. Se estiver usando um contador de células automatizado, defina os parâmetros apropriados para o tamanho e a circularidade da célula. Por exemplo, defina um tamanho mínimo de célula de 2 μm, um tamanho máximo de célula de 22 μm e uma circularidade de 75 a 80% de redondeza para detectar hemócitos normais e redondos. Experimente diferentes parâmetros para detectar hemócitos maiores e fusiformes, como lamelócitos. Como alternativa, use um hemocitômetro para contar manualmente os hemócitos.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Comprimidos PBS	MP Biomédicos	2810305
prato de dissecação	Corning	7220-85
tubo de microcentrífuga	Denville	C2170
almofada de dissecação de silicone, feita do kit Sylgard 184	Krayden (distribuído pela Fisher)	NC9644388 (número de catálogo da Fisher)	Feito em placa de Petri misturando componentes do kit de elastômero Sylgard de acordo com as instruções do fabricante.
estereomicroscópio	Morrell Instruments (distribuidor Nikon)	MNA42000, MMA36300	Modelos Nikon SMZ1000 e SMZ645
lenço de papel	VWR	82003-820
fórceps	Ciências da Microscopia Eletrônica	72700-DZ
pipeta p200	Eppendorf	3120000054
Contador de Células Automatizado Countess	Invitrogen	C10227
Lâminas da câmara de contagem de células da condessa	Invitrogen	C10283
hemocitômetro	Hausser Científico	3200
mancha azul trypan	Tecnologias da Vida	T10282