Dissecção do complexo olho-cérebro de pupas de moscas: um método para isolar o tecido retiniano

Abstract

Fonte: DeAngelis, M. W., Johnson, R. I. Dissecção da Retina Pupal de Drosophila para Imuno-Histoquímica, Análise Ocidental e Isolamento de RNA. J. Vis. Exp.(2019).

Este vídeo descreve como dissecar e isolar o complexo olho-cérebro das pupas de Drosophila. O protocolo apresentado demonstra o procedimento produzindo tecido de alta qualidade, compatível com, por exemplo, imunocoloração, bem como outros experimentos de expressão gênica.

Protocol

Este protocolo é um trecho de DeAngelis e Johnson, Dissecção da Retina Pupal de Drosophila para Imuno-Histoquímica, Análise Ocidental e Isolamento de RNA, J. Vis. Exp.(2019).

1. Preparação de tecidos

1. Configure cruzamentos de Drosophila (conforme descrito anteriormente em Greenspan, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (2004)) ou cepas de Drosophila específicas da cultura para obter pupas do genótipo desejado. Para garantir que um grande número de pupas surja coincidentemente, estabeleça essas culturas de moscas em duplicata em meios alimentares ricos em nutrientes ou meios alimentares padrão generosamente suplementados com pasta de fermento.
2. Manter as culturas de Drosophila a 25 °C. Para cruzamentos que utilizam o sistema UAS-GAL4, o GMR-GAL4 é um condutor ideal expresso em células do disco ocular larval posterior ao sulco morfogenético e ao longo do desenvolvimento pupal. O cruzamento UAS-lacZ X GMR-GAL4 serve como um cruzamento de controle ideal, pois impulsiona a expressão da proteína β-galactosidase não endógena e inerte.
3. Use a ponta de uma tala de bambu de 6" que foi molhada com água destilada para levantar suavemente as pré-pupas brancas (Figure 1B) da lateral dos frascos de cultura saudáveis (Figure 1A) e coloque em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL (Figure 1C).
4. Coloque os tubos em uma caixa plástica de ponta de pipeta junto com um pequeno pedaço de tecido embebido em água destilada para manter a câmara em umidade suficiente para proteger as pupas da dessecação (Figura 1D). Incubar as pupas a 25 °C até à dissecção.
5. Use uma tala de bambu seca de 6" para empurrar suavemente as pupas para fora do tubo de microcentrífuga e colocá-las em um prato de dissecação preto. Coloque um novo pedaço de fita dupla-face no prato de dissecação, longe das pupas.
6. Usando uma pinça, coloque cuidadosamente as pupas com o lado dorsal para cima (ou seja, opérculos voltados para cima, Figura 1B) na fita (Figura 2A). Certifique-se de que as pupas adiram bem à fita.
   OBSERVAÇÃO: A umidade na caixa da pupa inibirá a adesão segura à fita e, nesse caso, permita que as pupas sequem ao ar antes de colocá-las na fita dupla-face.

2. Dissecção de complexos olho-cérebro

1. Use uma pinça para remover o opérculo de cada pupa (Figura 2C).
2. Use uma tesoura de microdissecção para cortar ou cortar a caixa de pupa de cada pupa. Abra a caixa pupal para revelar a cabeça, o tórax e o segmento abdominal anterior, prendendo as bordas da caixa pupal à fita dupla face (Figura 2C).
   OBSERVAÇÃO: Não é necessário revelar totalmente as pupas.
3. Perfure o abdômen de cada pupa com uma pinça afiada, para agarrar o animal, e remova-o de sua caixa de pupa (Figura 2C).
4. Coloque as pupas na placa de dissecação preta, longe da fita, e cubra com cerca de 400 μL de solução tamponada com fosfato gelado (PBS, pH 7,4).
5. Segure cada pupa pelo abdômen com uma pinça e, com uma tesoura de microdissecação, faça um corte transversal limpo em todo o tórax, cortando a pupa ao meio (Figura 2D).
6. Retirar o resto posterior de cada carcaça do PBS e colocá-lo de lado na cápsula de dissecação (não deitar fora, ver passo 3.2.1).
7. Usando dois pares de pinças finas, abra o tórax e a cabeça de cada pupa para revelar o complexo olho-cérebro (Figura 2E). Para fazer isso, segure as bordas cortadas do epitélio do tórax e gradualmente rasgue para abrir o tórax e depois a cápsula da cabeça, expondo o complexo olho-cérebro e o tecido adiposo circundante.
8. Sem agarrar o tecido, use uma pinça para guiar o complexo olho-cérebro para longe dos restos da cápsula da cabeça ou retire o complexo olho-cérebro da cápsula da cabeça rasgada.
   OBSERVAÇÃO: O complexo olho-cérebro é em forma de haltere, esbranquiçado e mais translúcido do que a gordura de cor creme circundante (Figura 2B,E).
9. Com uma pinça, remova cuidadosamente a maior parte da gordura associada aos complexos olho-cérebro sem tocar no tecido ocular.

3. Processamento de Tecido para Imunofluorescência

1. Dissecar pelo menos 6-10 pupas conforme descrito (etapas 2.1-2.9).
   OBSERVAÇÃO: Três a quatro réplicas independentes de cada dissecção tendem a produzir dados suficientes para testar uma hipótese.
2. Lavagem e Fixação
   1. Corte a ponta de uma ponta de pipeta P20 ou P100 com uma lâmina de barbear limpa para aumentar a abertura da ponta para ~ 1 mm de raio e lubrifique pipetando uma mistura de PBS e gordura para cima e para baixo. Esta gordura pode ser obtida a partir dos restos da carcaça removidos no passo 2.6.
   2. Transfira os complexos olho-cérebro para ~ 400 μL de PBS em um prato de vidro de 9 poços, no gelo. Use a ponta lubrificada e uma micropipeta de deslocamento de ar P20 ou P100 para transferir.
      OBSERVAÇÃO: Os complexos olho-cérebro aderem às pontas não lubrificadas durante a pipetagem e são danificados ou perdidos.
   3. Remova a gordura restante associada ao tecido ocular pipetando o PBS para cima e para baixo para girar suavemente os complexos olho-cérebro. Nesta e em todas as etapas de lavagem subsequentes, não pipete diretamente os complexos olho-cérebro para cima e para baixo, pois isso danificará o tecido ocular frágil.
   4. Transfira os complexos olho-cérebro em um volume mínimo (<20 μL) de PBS para pelo menos 250 μL de fixador. Misture pipetando a solução para cima e para baixo. Incubar por 35 min, em gelo.
      OBSERVAÇÃO: A mesma ponta lubrificada preparada na etapa 3.1.1 pode ser usada para esta transferência.
   5. Com a mesma ponta de pipeta, transfira os complexos olho-cérebro para um poço contendo ~ 400 μL de PBS. Misture pipetando a solução para cima e para baixo e incube por 5-10 min no gelo, para lavar. Repita a etapa de lavagem pelo menos duas vezes.
      OBSERVAÇÃO: Os complexos olho-cérebro podem ser mantidos por várias horas na lavagem final do PBS, no gelo ou a 4 ° C, antes de prosseguir para a Etapa 3.3.1.
3. Coloração de anticorpos
   1. Para bloquear o tecido antes da exposição a soluções de anticorpos, transfira os complexos olho-cérebro para ~ 400 μL de PBT. Use a ponta lubrificada e uma micropipeta de deslocamento de ar P20 ou P100 para a transferência. Incube por 10 a 60 min, no gelo.
   2. Prepare a solução de anticorpos primários diluindo os anticorpos apropriados em PBT. Como os complexos olho-cérebro são incubados em alíquotas de 10 μL de solução de anticorpos, o volume preparado será uma réplica de 10.
   3. Alíquota de 10 μL de solução de anticorpos em um poço limpo de uma bandeja de micropoços de 72 poços.
   4. Corte a ponta de uma ponta de pipeta P10 com uma lâmina de barbear limpa para aumentar a abertura da ponta para ~0.5 mm de raio e lubrifique pipetando PBT para cima e para baixo.
   5. Transfira não mais do que 5 complexos olho-cérebro, em um volume de <3 μL de PBS, para cada poço de 10 μL de solução de anticorpos usando uma micropipeta de deslocamento de ar P10 e a ponta lubrificada.
   6. Homogeneizar a solução de anticorpos pipetando a solução para cima e para baixo. Não pipete os complexos olho-cérebro para cima e para baixo, pois isso danificará o tecido.
   7. Para minimizar a evaporação da solução de anticorpos, coloque um pequeno pedaço de tecido embebido em água destilada na bandeja de micropoços e sele a bandeja (por exemplo, com a tampa fornecida). Incubar durante a noite a 4 °C.
   8. Transfira os complexos olho-cérebro da bandeja de micropoços para ~ 400 μL de PBT em um prato de vidro de 9 poços, para lavar. Use uma micropipeta de deslocamento de ar P10 e uma ponta lubrificada com PBT (prepare conforme descrito na etapa 3.3.4). Misture pipetando a solução para cima e para baixo. Incube por 5-10 min no gelo.
   9. Repita a etapa de lavagem pelo menos duas vezes. Use uma micropipeta de deslocamento de ar P20 ou P100 e uma ponta lubrificada com PBT para transferir os complexos olho-cérebro entre as soluções de lavagem.
   10. Prepare a solução de anticorpos secundários diluindo os anticorpos secundários marcados com fluoróforo apropriados em PBT, conforme necessário. 100 μL de solução de anticorpos secundários são suficientes por lote de 6-10 pupas. Alíquota da solução de anticorpos secundários para uma placa de dissecação de vidro de 9 poços.
   11. Transfira os complexos olho-cérebro para uma solução secundária de anticorpos. Use uma micropipeta de deslocamento de ar P20 ou P100 e uma ponta lubrificada com PBT para a transferência.
   12. Incubar os complexos olho-cérebro em solução secundária de anticorpos durante 1-2 h à temperatura ambiente ou 3-5 h a 4 °C. Para evitar o branqueamento de fluoróforos pela luz, cubra a preparação com papel alumínio.
       OBSERVAÇÃO: A duração ideal da incubação em solução de anticorpos secundários pode diferir de acordo com os anticorpos primários e secundários utilizados.
   13. Transfira os complexos olho-cérebro para ~ 400 μL de PBT em um prato de vidro de 9 poços, para lavar. Misture pipetando a solução para cima e para baixo. Incube por 5-10 min no gelo. Esta etapa de lavagem deve ser repetida pelo menos duas vezes.
4. Fixação Secundária
   1. Para uma fixação secundária, transfira os complexos olho-cérebro para pelo menos 200 μL de fixador e incube por 20 min à temperatura ambiente ou 35 min a 4 °C.
      OBSERVAÇÃO: A fixação secundária enrijece o tecido ocular, o que auxilia na montagem (etapa 3.5).
   2. Use uma micropipeta de deslocamento de ar P20 ou P100 e uma ponta lubrificada com PBT para transferir complexos olho-cérebro para ~ 400 μL de PBT em um prato de vidro de 9 poços, no gelo, para lavar por 5 min.
   3. Repita a etapa de lavagem pelo menos uma vez.
   4. Use uma micropipeta de deslocamento de ar P20 ou P100 e uma ponta lubrificada com PBT para transferir os complexos olho-cérebro para ~ 400 μL de PBS em um prato de vidro de 9 poços, no gelo, para enxaguar por 1-2 min. Mantenha o tecido em movimento pipetando o PBS, mas não o tecido, para cima e para baixo para evitar que os complexos olho-cérebro se assentem e adiram ao prato de vidro durante o enxágue com PBS.
5. montagem
   1. Transfira os complexos olho-cérebro para ~ 200 μL de mídia de montagem. Use uma micropipeta de deslocamento de ar P20 ou P100 e uma ponta lubrificada com PBT para transferir os complexos olho-cérebro. Deixe o tecido se equilibrar no meio de montagem por 1-2 h.
   2. Coloque uma gota de 5-8 μL de mídia de montagem nova em uma lâmina de microscópio limpa.
   3. Corte uma ponta P10 com uma lâmina de barbear limpa para aumentar a abertura da ponta para ~0.5 mm de raio e use isso e uma micropipeta de deslocamento de ar P10 para transferir os complexos olho-cérebro em 5-8 μL de mídia de montagem para a gota da mídia de montagem na lâmina.
   4. Use duas agulhas de tungstênio para separar os olhos dos lobos ópticos. Prenda um complexo olho-cérebro na lâmina com uma agulha de tungstênio resistente e corte cada olho de seu lobo óptico associado com uma agulha fina de tungstênio (Figura 2F).
   5. Use a agulha fina de tungstênio para manobrar cada olho para a superfície da lâmina do microscópio com a superfície basal de cada olho adjacente à lâmina. Abaixe suavemente uma lamínula limpa sobre o lenço e prenda com esmalte.
      OBSERVAÇÃO: Organizar os olhos na lâmina de forma que fiquem próximos um do outro ou alinhados facilitará a microscopia subsequente.
   6. Imageie as retinas usando microscopia fluorescente ou confocal.
      OBSERVAÇÃO: As lâminas devem ser armazenadas a 4 °C se não forem fotografadas imediatamente.

Results

Figura 1: Seleção e cultura de pupas para dissecção. (A) Larvas e pupas errantes de terceiro ínstar larval (L3) localizam-se ao longo dos lados de culturas saudáveis de Drosophila. (B) As pré-pupas podem ser identificadas por sua cor branca translúcida, pois o pigmento ainda não foi gerado no caso da pupa protetora. Os eixos ântero-posterior e dorsal-ventral da pupa são mostrado...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Talas de bambu, 6"	Ted Pella Inc	116
Prato de dissecação preto			Placa de Petri de vidro cheia até a borda com SYLG170 ou SYLG184 (de cor preta com pó de carvão finamente moído). Deixe em temperatura ambiente por 24-48 h para polimerizar.
Porta-lâminas	Ferramentas de Belas Ciências	Rolamento 10053
Albumina de soro bovino	Sigma-Aldrich	Rolamento A7906
Fita dupla face	3m	Episódio 665
Drosophila e meios alimentares, ricos em nutrientes			7,5% sacarose, 15% glicose, 2,5% ágar, 20% levedura de cerveja, 5% peptona, 0,125% MgSO4.7H2O, 0,125% CaCl2.2H20
Drosophila e meios alimentares, padrão			Bloomington Drosophila Stock receita de fubá do centro. (https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html)
Solução fixadora			4% de formadeído em PBS, pH 7,4.
fórceps	Ferramentas de Belas Ciências	91150-20	A pinça deve ser afiada com frequência.
Formaldeído	Thermo Científico	Rolamento 28908
Pratos de vidro de 9 poços	Corning	7220-85	Também conhecido como pratos de 9 poços
Lamínulas de vidro (22 x 22 mm)	Fisher Científico	12-542-B
Lâminas de microscópio de vidro (25 x 75 x 1 mm)	Fisher Científico	12-550-413
Placa de Petri de vidro	Corning	3160-100BO
Glicerol	Sigma-Aldrich	G5516
Tubos de microcentrígura	Axygen	MCT-175-C
Tesoura de microdissecção	Ferramentas de Belas Ciências	15000-03
Bandejas de micropoços (poços de 72 x 10 μL)	Nunc	438733
Mídia de montagem			0,5% de N-propilgalato e 80% de glicerol em PBS
N-propilgalato	Sigma-Aldrich	Pág. 3130
PBS (solução salina tamponada com fosfato pH 7,4)	Sigma-Aldrich	Pág. 5368	Prepare de acordo com as instruções do fabricante
Pbt			0,15% de TritonX e 0,5% de albumina de soro bovino em PBS, pH 7,4
Suporte de pino	Ferramentas de Belas Ciências	Rolamento 26016-12
Anticorpo primário: anti-GAPDH caprino	Imgenex	IMG-3073	Para Western blotting. Usado em 1:3000
Anticorpo primário: Dcp-1 anticlivado de coelho	Sinalização celular	9578S	Para imunofluorescência. Usado em 1:100
Anticorpo primário: anti-DEcad de rato	Banco de Hibridoma de Estudos do Desenvolvimento	DCAD2	Para imunofluorescência. Usado em 1:20
Anticorpo primário: anti-DEcad de rato	DOI: 10.1006/dbio.1994.1287	DCAD1	Presente de Tadashi Uemura. Usado em 1:100.
Lâminas de bisturi	Ferramentas de Belas Ciências	10050	Quebre um pequeno pedaço de lâmina scapel e prenda no suporte da lâmina.
Anticorpo secundário: IgG anti-rato de burro conjugado com 488 (H+L)	Jackson ImmunoResearch	Telefone: 712-545-153	Para imunofluorescência. Usado em 1:200
Anticorpo secundário: IgG anti-coelho de cabra conjugada com cy3 (H+L)	Jackson ImmunoResearch	111-165-144	Para imunofluorescência. Usado em 1:100
Anticorpo secundário: IgG anti-rato de cabra conjugada com HRP (H+L)	Tecnologia de sinalização celular	Pedido 7077	Para Western blotting. Usado em 1:3000
Anticorpo secundário: IgG anti-cabra de coelho conjugada com HRP (H+L)	Jackson ImmunoResearch	305-035-003	Para Western blotting. Usado em 1:3000
Microscópio de dissecação estéreo (M60 ou M80)	Leica Microsystems		ou microscópio similar
Sylgard (preto)	Dow Corning	SYLG170
Sylgard (transparente)	Dow Corning	SYLG184	Cor preta com pó de carvão finamente moído
Tecido: Kimwipes	KIMTECH	34120
TritonX	Sigma-Aldrich	T8787
Agulha de tungstênio fina	Ferramentas de Belas Ciências	Rolamento 10130-10	Insira no suporte do pino
Agulha de tungstênio, resistente	Ferramentas de Belas Ciências	Rolamento 10130-20	Insira no suporte do pino
Pasta de fermento	(supermercado local)		Aproximadamente 2 colheres de sopa de levedura ActiveDry de Fleischmann (ou similar) dissolvida em ~ 20 mL de H2O destilado