drosófila Dissecção do músculo de voo indireto (IFM) da pupa tardia: um método para coleta de tecido de alto rendimento

Resumo

Fonte: Kao, S. Y., et al. Dissecção dos músculos de vôo de Drosophila melanogaster para abordagens ômicas. J. Vis. Exp. (2019).

Os músculos de vôo da Drosophila são usados como um sistema modelo para o desenvolvimento e fisiologia muscular. Este vídeo descreve a musculatura de voo de adultos e destaca um protocolo para dissecar o desenvolvimento de músculos de voo indireto que são adequados para o sequenciamento de RNA de pupas.

Protocolo

Este protocolo é um trecho de Kao et al., Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches, J. Vis. Exp. (2019).

1. Dissecção IFM após 48 h APF

1. Monte o equipamento necessário, incluindo duas pinças de grau biológico #5, tesouras finas, lâminas de microscópio de vidro padrão, fita adesiva dupla, pipeta, pontas de pipeta, gelo seco e (para aplicações de RNA) reagente de isolamento (consulte a Tabela de Materiais). Resfrie os tubos 1x PBS e microcentrífuga no gelo.
2. Usando um pincel levemente umedecido, transfira as pupas estadiadas para uma tira de fita adesiva dupla face montada em uma lâmina de microscópio (Figura 1A). Colocar as pupas em uma linha, orientadas na mesma orientação (ventral para baixo e anterior em direção à parte inferior da lâmina).
   OBSERVAÇÃO: Tenha cuidado para não usar muita água no pincel ou filtro, ou as pupas não grudarão bem. Se as pupas não grudarem, seque-as primeiro transferindo-as para um filtro seco ou lenço de papel. Monte quantas pupas puderem ser dissecadas em uma janela de tempo de 30 minutos, idealmente ~ 10 pupas.
3. Remova a pupa da caixa de pupa. Use uma pinça para separar e abrir a caixa da pupa acima dos espiráculos anteriores (Figura 1B).
4. Deslize suavemente um par de pinças dorsalmente em direção à parte posterior, cortando a caixa da pupa à medida que a pinça se move (Figura 1B'). Tenha cuidado para não romper a pupa subjacente. Libere a pupa da caixa aberta e transfira-a imediatamente para uma gota de 1x PBS em uma segunda lâmina de microscópio (Figura 1B",C).
5. Repita as etapas 1.3 e 1.4 para todas as pupas da linha e, em seguida, coloque a lâmina de fita adesiva dupla de lado.
6. Usando a tesoura fina, corte o abdômen da pupa longe do tórax e empurre-o para uma pilha separada (Figura 1D,D'). Repita para as pupas restantes.
   OBSERVAÇÃO: Comece a cronometrar a duração da dissecção com a etapa 1.6, assim que a integridade da pupa for interrompida. Disseque o maior número possível de moscas em 20 a 30 minutos para evitar a morte celular e as alterações transcriptômicas e proteômicas associadas. Ao dissecar adultos 1 d ou pupas de >90 h, muitas vezes é conveniente para etapas posteriores remover adicionalmente a cabeça com a tesoura fina.
7. Usando um lenço de papel, remova a maior parte do PBS 1x (geralmente turvo com gordura suspensa), bem como a pilha de abdômen (Figura 1E). Adicione uma gota de PBS 1x fresco e resfriado aos tórax restantes.
8. Use a tesoura para cortar o tórax ao meio (Figura 1F,F') cortando da cabeça para baixo o eixo longitudinal do corpo em um único movimento. Alternativamente, se a cabeça foi removida, primeiro insira a tesoura onde a cabeça estava presa e corte a metade superior do tórax longitudinalmente entre os IFMs. Em seguida, corte o lado ventral do tórax com um segundo corte na mesma orientação.
9. Repita as etapas 1.7 e 1.8 para que todas as pupas sejam dissecadas, gerando uma pilha de hemissecções do tórax perto do centro da lâmina. Certifique-se de que haja 1x PBS resfriado suficiente na lâmina para que as hemisseções não sequem.
   OBSERVAÇÃO: Após 48 h APF, os IFMs são grandes o suficiente para serem visíveis sob um microscópio de dissecação padrão para o olho treinado. Neste ponto do protocolo, os músculos com um marcador fluorescente podem ser movidos para um escopo de dissecação fluorescente para auxiliar na identificação da IFM ou para fins de treinamento, mas isso não é necessário.
10. Disseque os IFMs do tórax. Isole uma das hemissecções usando a pinça # 5 ( Figura 1G, H). Insira suavemente as pontas de uma pinça acima e abaixo do meio dos IFMs (Figura 1G',H'). Enquanto segura a primeira pinça, use uma tesoura fina para cortar uma extremidade do IFM da cutícula e dos tendões. Em seguida, corte a outra extremidade do IFM da cutícula (Figura 1G'',H'').
    OBSERVAÇÃO: Dependendo da orientação do tórax após o primeiro corte IFM, é útil girar o tórax 180° para que o segundo corte IFM seja mais fácil de executar.
11. Remova o feixe IFM do tórax com uma pinça (Figura 1G''',H'''), transferindo-o para a borda da bolha PBS para usar a tensão da água para mantê-lo no lugar (Figura 1I). Empurrar a carcaça para o lado oposto da lâmina. Repita para as hemissecções restantes do tórax, gerando uma coleção de IFMs dissecadas.
    OBSERVAÇÃO: Se os IFMs não ficarem em uma pilha organizada, remova um pouco do PBS 1x com um lenço de papel. Tenha cuidado para não deixar todo o PBS evaporar e certifique-se de que os IFMs e hemitórax dissecados permaneçam cobertos por tampão.
12. Depois de dissecar todos os IFMs, execute rapidamente um controle de qualidade no músculo dissecado. Usando a pinça #5, remova qualquer músculo de salto ou fragmentos de cutícula que possam ter entrado na amostra (Figura 1J-K'').
    OBSERVAÇÃO: O músculo do salto parece diferente do IFM. Se dissecar o músculo marcado com Mef2-Gal4 sob fluorescência, o músculo do salto tem uma fluorescência mais fraca e uma forma e textura diferentes. Sob luz normal, parece quase translúcido, enquanto os IFMs são um amarelo leitoso opaco (Figura 1JJ '', K).
13. Usando a tensão da água, capture (mas não esmague) os IFMs dissecados entre um par de pinças (Figura 1L). Transfira os IFMs para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL pré-preenchido com 250 μL de PBS 1x resfriado (Figura 1M). Prossiga imediatamente com a seção 2.
    OBSERVAÇÃO: Quando as pontas das pinças são aproximadas umas das outras e retiradas de uma solução tampão, a tensão da água faz com que uma bolha de tampão seja capturada entre as pontas das pinças. Se os IFMs também estiverem presentes nesta bolha, eles podem ser retirados da solução e facilmente transferidos para outro recipiente cheio de tampão. É importante apertar a pinça para aproximar as pontas umas das outras sem se tocar, para evitar a maceração do tecido capturado na bolha tampão.

2. Granular e preservar a amostra IFM

1. Pulverize os IFMs centrifugando o tubo de microcentrífuga de 1,5 mL por 3–5 min a 2.000 x g em uma centrífuga de mesa (Figura 2A,B).
2. Remova o tampão usando uma ponta de pipeta (Figura 2C).
3. Para aplicações de RNA, ressuspenda o pellet IFM em 50–100 μL do tampão de isolamento de RNA desejado (consulte a Tabela de Materiais, Figura 2D). Caso contrário, prossiga para a etapa 2.4.
   OBSERVAÇÃO: Os IFMs podem ser congelados a seco após a etapa 2.2 para preparações de espectrometria de massa ou isolamento de RNA com kits comerciais (ver resultados representativos). Para aplicações de RNA, melhores resultados são obtidos ressuspendendo e congelando imediatamente o pellet IFM em tampão de isolamento.
4. Congele a amostra em gelo seco ou congele em nitrogênio líquido (Figura 2E). Armazene a -80 °C até que esteja pronto para as etapas subsequentes na preparação da amostra para análise posterior.
   OBSERVAÇÃO: Após a criopreservação, as amostras podem ser armazenadas por vários meses antes de serem processadas para investigação a jusante.

Resultados

Figura 1: Dissecção de IFMs após 48 h APF. (A) Alinhamento de pupas em fita adesiva dupla. (B) Remoção de pupas da caixa de pupa abrindo anteriormente, cortando a caixa dorsalmente (B ') e levantando a pupa (B ''). Os símbolos de círculo representavam o mesmo que a Figura 2. (C) Transferência de pupas para tampão. (

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Placas de cultura de 60 mm	Sigma-Aldrich	Z643084-600EA	Pratos de greiner, 60 mm x 15 mM, ventilados
Câmera do telefone celular, Samsung Galaxy S9	Samsung	SM-G960F/DS	usado para fotos não tiradas ao microscópio
Fita adesiva dupla	Escocês/3M	3M ID 70005108587	Fita dupla face, disponível na maioria dos manipuladores de material de escritório
Dumont #5 Fórceps	Ferramentas de Belas Ciências	11252-20	Pinça de ponta reta em inox de 11 cm, grau de biologia com ponta de 0,05 mm x 0,02 mm
câmera de microscópio de dissecação fluorescente, câmera Leica DFC310 FX	Leica		www.leica-microsystems.com
Software de microscópio de dissecação fluorescente, Leica Application Suite (LAS) versão 4.0.0	Leica		www.leica-microsystems.com
Microscópio de dissecação fluorescente, Leica M165 FC	Leica		www.leica-microsystems.com
Voar: Bru1[M2]			Estoque de moscas; Este artigo
Voar: Bru1[M3]			Estoque de moscas; Este artigo
Voar: Mef2-GAL4	Centro de Estoque de Bloomington	BDSC: 27390	Estoque de moscas
Voar: salm[1]	Centro de Estoque de Bloomington	3274	Estoque de moscas
Mosca: salm[FRT]			Estoque de moscas; ver Spletter et al., Elife, 2018
Voar: UAS-Bru1IR	Centro de Pesquisa de Drosophila de Viena	GD41568	Estoque de moscas, grampo de RNAi
Voar: UAS-GFP::Gma	Centro de Estoque de Bloomington	BDSC: 31776	Estoque de moscas
Voar: UAS-mCD8a::GFP	Centro de Estoque de Bloomington	BDSC: 5130	Estoque de moscas
Voar: w [1118]	Centro de Estoque de Bloomington	3605	Estoque de moscas
Voar: weeP26			Estoque de moscas; ver Clyne et al., Genetics, 2003
Reagente de detecção GFP, GFP-Booster	ChromoTek	GBA488-100
glicogénio	Invitrogen	Rolamento 10814-010
Software de processamento de imagem, Photoshop CS6	adobe		www.adobe.com
Isopropanol	Sigma-Aldrich	I9516-25ML	2-propanol
Método 1 (isolamento de RNA): TRIzol	Tecnologias da Vida	15596018	Solução de isotiocianato de guanidínio e fenol monofásico
Método 2 (isolamento de RNA): Método 1 + Kit TURBO sem DNA	Invitrogen	AM1907	Isolamento de TRIzol seguido de tratamento com kit para remoção de DNA
Método 3 (isolamento de RNA): Kit Miniprep Plus de RNA Direct-zol	Pesquisa Zymo	R2070S	Isolamento de RNA em TRIzol, mas em colunas comerciais em vez de usar separação de fases. Tratamento recomendado com DNase realizado com Monarch Dnase I em tampão de reação Monarch DNase I.
Método 4 (isolamento de RNA): RNeasy Plus Mini Kit	Qiagen	Nº 74134	Usamos o tratamento DNase fornecido. Os pellets de IFM foram homogeneizados em tampão RTL conforme sugerido para tecidos animais.
Método 5 (isolamento de RNA): Sistema ReliaPrep RNA Tissue Miniprep	Promega	Z6110	Aplicou-se o protocolo de 'Purificação de RNA de Tecidos Fibrosos'.
Método 6 (isolamento de RNA): Kit de minipreparação de RNA total Monarch	Biolabs da Nova Inglaterra	T2010G	Aplicamos o protocolo para tecidos/leucócitos e lisamos em 300 μL de RNA Reagente de Proteção.
Tubos de microcentrífuga	Thermo Fisher	AM12400	Tubos de microcentrífuga sem RNase, 1,5 mL
Lâminas de microscópio	Thermo Fisher	12342108	Corrediças padrão, sem carga, 1 mm
pincel	Marabu	Rolamento 1910000000	Marabu Fino Round No. 0, ou pincel semelhante de qualquer material de arte
Paraformaldeído	Sigma-Aldrich	158127
Tampão PBS (1x)	Sigma-Aldrich	Pág. 4417	Pastilhas salinas tamponadas com fosfato para soluções de 1 L, pH 7,4
Ponteiras de pipeta PFA PureTip	Elemental Científico	ES-7000-0101	Substituto opcional para ponteiras de pipeta padrão para reduzir a perda de amostra; 100 mL, orifício de 0,8 mm
Pontas de pipeta	Sigma-Aldrich	Pág. 5161	Ponteiras de pipeta universais de 200 mL
Concentração de RNA Abordagem 1 & Traços de integridade de RNA, Bioanalisador	Tecnologias Agilent	G2939BA
Concentração de RNA Abordagem 2, Nanodrop	Thermo Fisher	ND-2000
Concentração de RNA Abordagem 3, Fluorômetro Qubit 4	Invitrogen	Pergunta 33238
RNase A	Promega	Resposta 7937
Água isenta de RNase, dietilpirocarbonato (DEPC)	Sigma-Aldrich	D5758	A DEPC trata a água durante a noite e depois a autoclave, para remover toda a RNase.
Kit RT #1: Kit de transcriptase reversa Super Script III	Invitrogen	18080-044	kit de transcrição reversa
Kit RT #2: LunaScript	Biolabs da Nova Inglaterra	E3010S	kit de transcrição reversa
Kit RT #3: Kit de Transcrição Reversa QuantiNova	Qiagen	Rolamento 205410	kit de transcrição reversa
Software estatístico: GraphPad Prism	Prisma do GraphPad		www.graphpad.com
Software estatístico: Microscoft Excel	Microsoft		Comprado como parte do pacote: Office Home & Student 2019
Centrífuga de mesa	Eppendorf	5405000760	Centrífuga Eppendorf 5425 ou equivalente
Lenços de papel/Kimwipes	Sigma-Aldrich	Z188956	Lenços de tecido padrão
Pipeta de transferência	Sigma-Aldrich	Z350796	Pipeta em material plástico
Tesoura de mola Vannas	Ferramentas de Belas Ciências	15000-00	Aresta de corte de 3 mm, diâmetro da ponta 0,05 mm, comprimento 8 cm
Papel Whatman	Sigma-Aldrich	1004-070	Círculos de papel de filtro, Grau 4, 70 mm